功能性PEDOT神经接口的多模态体外生物相容性评估

《iScience》：Multimodal in vitro biocompatibility assessment of functionalized PEDOT neural interfaces

　　亮点：
- 功能化PEDOT-多巴胺涂层在实验室条件下表现出优异的性能
- 常规体外测试证实了各种配方对细胞存活率的良好影响
- 多模式测试框架揭示了不同变体之间的基底依赖性差异
- 涂层引导细胞组织、聚集以及细胞与基质的相互作用

摘要：
导电聚合物（如聚(3,4-乙烯二氧噻吩)：聚苯乙烯磺酸盐 (PEDOT:PSS)）由于其良好的电化学和机械性能，已成为有前景的神经接口材料。然而，对新生物电极涂层的生物学评估仍然依赖于传统的细胞毒性测定和动物研究，这限制了我们对细胞-材料相互作用的理解。在这里，我们提出了一种多模式的体外框架，用于评估功能化PEDOT涂层的生物相容性作为神经接口材料。标准的PEDOT:PSS、功能化PEDOT:多巴胺 (PDA) 和PEDOT:多巴胺接枝透明质酸 (DAHA) 涂层通过电化学方法进行了表征，并使用SH-SY5Y细胞进行了存活率测量、轮廓仪分析、3D重建、免疫荧光成像和靶向基因表达分析。虽然所有涂层都支持细胞存活，但在细胞组织、多细胞聚集、细胞外基质-和 focal-粘附相关结构以及与细胞-基质相互作用和细胞间通信相关的基因表达方面观察到了基底依赖性差异。我们的发现提供了超越传统测试的机制洞察，这是指导体内实验前材料开发的重要中间步骤。

图形摘要
引言：
近期在神经电子接口方面的进展为基于电疗的诊断和治疗策略带来了前所未有的机会，以针对各种神经系统疾病，并恢复丧失的功能。典型的神经电子系统包括一个植入的生物电子接口（例如电极阵列），它在离子导电的发电神经组织和电子电路之间转换电荷，然后连接到植入的电子组件和/或电缆，以连接到经皮连接端口。这类系统的核心是构成植入设备与目标神经组织之间电化学接口的导电材料。用于量化此类接口材料性能的工程指标涵盖了电子学、电化学和力学领域。理想的生物电极接口材料应具有高电导率，以降低电极-组织电流回路的串联电阻；大充电储能容量 (CSC)，以增加可用于转换的电荷储备；大充电注入容量 (CIC)，以实现电压高效且电化学安全的神经组织电流控制刺激；低弹性模量，以减少电极-组织界面的机械不匹配；以及与神经组织的化学表面亲和力，以减轻生物污染和免疫反应，这些都会影响设备的寿命。当前的技术领域分为两类材料：一类用于临床级设备，另一类是在研究环境中开发的。临床级设备使用的材料组合在性能与降低监管合规性之间进行了权衡。因此，临床级设备中典型的电极材料是铂 (Pt)、铂-铱 (PtIr) 合金或氮化钛。虽然这些材料在标准护理应用中能够满足需求，例如用于 <30 天的神经监测的低分辨率厘米级脑电图记录或用于神经性疼痛缓解的慢性硬膜外脊髓刺激，但新的生物电子医学应用需要性能更好的材料，使科学家能够扩展神经接口的功能，超越目前患者可用的基本功能。在这种背景下，科学文献展示了一系列显著提高性能的生物电极材料，这些材料通过前面详细描述的指标进行了量化。特别是基于聚(3,4-乙烯二氧噻吩) (PEDOT) 的导电聚合物因其合成和集成过程中的可调性而成为理想的接口材料。具体来说，这些聚合物在应用于电极接口时提供了几个优势：它们具有混合的电子-离子导电性、体积电容，使它们成为金属导体和植入式设备之间的电荷转换器；其充电储能容量 (CSC) 和充电注入容量 (CIC) 比标准铂-铱 (PtIr) 电极高出几个数量级，从而提高了体内神经生理记录和神经刺激的性能。此外，像 PEDOT:聚苯乙烯磺酸盐 (PSS) 这样的导电聚合物与周围软组织的机械结合更好，其弹性模量约为 1 GPa，而金属电极的弹性模量约为 100 GPa，与神经组织的界面压力约为 10–100 kPa。这些材料的另一个优势在于它们的可制造性，可以选择多种合成和聚合技术，以及沉积和集成到完整设备中的方法，如电聚合、旋涂/喷涂或铸造。这些技术与标准的微制造工艺流程兼容，因此支持广泛的尺寸和批次可扩展性。最后，导电PEDOT聚合物还可以进一步用不同的分子功能化电极接口，以实现额外的功能。例如，可以用其他分子（如 ClO4、PF6、四乙基铵高氯酸盐 (TEAP)、对甲苯磺酸盐 (p-TS)、碳纳米管 (CNT) 或基于锂的离子（例如 LiBF4、LiPF6 等）替代 PSS（一种常见的电聚合共离子），这些已被证明可以改善电导率和孔隙率。

尽管已经发表了大量关于改进的生物电极涂层的合成、集成和实验室表征的研究，这些新材料在生物电子医学应用中的生物学验证主要限于动物模型中的生物相容性和功能测试。这在成本和伦理负担方面带来了重大挑战，而对于开发更先进的体外协议以揭示生物电极接口与细胞之间相互作用的努力相对较少。目前的体外评估策略通常依赖于代谢活性和存活率测定，如 MTT (3-(4,5-二甲基噻唑-2-yl)-2,5-二苯基四唑溴化物)、AlamarBlue 或活/死染色，这些方法主要提供关于细胞存活和急性细胞毒性的信息。尽管这些方法很有信息量，但它们对细胞组织、粘附、细胞外基质 (ECM) 重塑、细胞骨架结构和细胞间通信等更微妙的基底依赖性效应提供的洞察有限，而这些都对植入物神经接口的生物学整合有所贡献。对于神经接口材料来说，这些过程的表征尤为重要，因为成功的长期整合不仅取决于维持细胞存活率，还取决于建立植入材料与周围组织之间的有利物理化学相互作用。越来越多的证据表明，表面化学、地形、润湿性和机械性能可以影响细胞形态、细胞骨架组织、ECM沉积、focal-粘附形成和细胞间通信，所有这些都影响生物材料接口处的生物学反应。因此，需要更全面的体外评估策略。在这里，我们提出了一种多模式的神经接口电极涂层生物相容性评估方法，结合了互补的电化学、结构、形态和分子表征技术。我们整合了从细胞形态和多细胞结构到蛋白质定位和基因表达等多个层次的测量。这种框架比任何单一技术都能提供更全面的细胞-材料相互作用评估。我们选择了 SH-SY5Y 人神经母细胞瘤来源的细胞作为可重复的、广泛使用的类神经元模型，用于比较不同涂层配方下的细胞-材料相互作用。定量成像和 3D 表面重建用于评估细胞分布、形态和多细胞组织，而免疫荧光和靶向基因表达分析评估了与神经元表型、ECM 组织、细胞粘附、突触功能和细胞间通信相关的选定标志物。这种方法提供了对测试材料的更系统评估，能够识别仅通过常规细胞毒性测试无法捕捉到的细微基底依赖性效应。为了展示和验证这一框架，我们将其应用于一系列为神经接口应用开发的基于 PEDOT 的生物电极涂层。

我们选择测试材料的原因在于表明，传统的高性能 PEDOT 涂层（如 PEDOT:PSS）在标准评估条件下确实表现出细胞存活率；然而，当利用这些涂层的进一步功能化能力时，细胞相互作用可以以标准体外测试无法发现的方式被调节。为了突出这一点，我们设计、合成并将以下涂层集成到微制造的测试电极中：标准 PEDOT:PSS、PEDOT:多巴胺 (PDA) 以及与多巴胺接枝透明质酸 (DAHA) 共电聚合的PEDOT。选择多巴胺作为神经接口的官能化剂，是因为它同时具有通用生物粘附剂和电活性物质的双重作用，后者含有儿茶酚基团，能够直接参与电聚合过程，而透明质酸 (HA) 则不具备这一特性。几项最近的研究支持基于多巴胺的 PEDOT 复合物作为神经接口材料的潜力：PEDOT:PDA 微电极表现出低阻抗、高 CSC 和高充电注入限制。我们进一步假设，将 HA 作为天然存在于神经 ECM 中的互补生物活性分子纳入其中，可以促进或改变细胞的反应性，与 PEDOT:PSS 和 PEDOT:PDA 相比。我们测试了两种不同的化学路线来合成 DAHA 共离子，使用碳二亚胺偶联或 HA 氧化。这种选择是基于功能化效率和结构完整性的权衡。据报道，使用过氧化钠 (NaIO4) 进行的 HA 氧化可以获得更高的接枝度（最高可达 45%），但可能会以牺牲生物活性为代价，因为这种化学途径涉及 HA 环的打开。相比之下，使用 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺 (EDC) 和 N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 进行的碳二亚胺偶联可以保留 HA 的骨架，但其较低的接枝度（最高可达 20%）可能会减弱涂层的界面粘附性。根据之前的考虑和目标，我们的研究包括以下样本组：玻璃（对照，通常用于细胞测定）、裸露的溅射金（对照，典型的电极涂层基底）、PEDOT:PSS（基准神经接口涂层）、PEDOT:PDA（结合了 PEDOT 涂层的电化学性能和 PDA 的生物活性粘附的新界面材料）、PEDOT:DAHAEDC（用于 HA 涂层功能化的测试电极，EDC 合成）和 PEDOT:DAHANaIO4（用于 HA 涂层功能化的测试电极，NaIO4 合成）。

结果：
DAHA 前体的合成和化学分析：
多巴胺 (DA) 可以通过两种主要策略接枝到 HA 上。在 EDC/NHS 路径中，碳二亚胺化学使 HA 的羧基活化，使其与多巴胺的伯胺反应形成酰胺键，同时保留 HA 的骨架。在过氧化物路径中，HA 首先通过过氧化钠 (NaIO4) 氧化生成醛基，然后通过 Schiff 基形成与多巴胺结合，通常通过还原来稳定。这两种方法都会生成多巴胺接枝的 HA (DAHA, 图 1A)。这些 DAHA 前体通过衰减的总反射率-傅里叶变换红外 (ATR-FTIR) 和紫外-可见 (UV-vis) 光谱进行了表征。在 FTIR 光谱（图 1B）中，DAHAEDC 和 DAHANaIO4 中常见的 O–H 振动和 N–H 拉伸分别出现在 3,328/3,075 和 3,270 cm?1。同样，在 DAHANaIO4 中出现在 2,901 cm?1，在 DAHAEDC 中出现在 2,970 cm?1 的峰值与 HA 的烷基团中的 C–H 拉伸和 DA 的苯环中的 C–H 拉伸相关。DAHAEDC 中的 1,631 和 1,559 cm?1 的可见峰分别对应于新形成的酰胺键中的 C=O 拉伸和 N-H 弯曲。1,438 和 1,280 cm?1 的峰值是 DA 中常见的 C=C 和 C–O 拉伸振动。1,038 cm?1 的峰值对应于 HA 的葡萄糖苷键的 C–O–C 拉伸，在 DAHANaIO4 中也出现在 1,030 cm?1。在 DAHANaIO4 光谱中，1,603 cm?1 的峰值被归因于 HA 中的 C=O 和 DA 中的 N–H 弯曲，但它也可以归因于新形成的亚胺基团中的 C=N 振动。

图 1 前体的合成
显示完整标题
图表查看器
(A) 通过 EDC/NHS 碳二亚胺偶联和 NaIO4 氧化合成多巴胺接枝的 HA。
(B 和 C) (B) DA、HA 和 DAHA 产品的 ATR-FTIR 和 (C) UV-vis 光谱。
DA 在 HA 骨架中的存在进一步通过 UV-vis 光谱得到确认。DA 通常在 280 nm 处吸收，而 HA 在该波长范围内保持完全平坦。图 1C 中的 UV-vis 光谱显示 DAHANaIO4 在 280 nm 处有峰值，而 DAHAEDC 在 275 nm 处有峰值。这种波长差异可以由每种偶联策略形成的化学键的不同解释。在 DAHANaIO4 中，DA 首先被氧化，然后通过醛介导的反应结合，因此与自由多巴胺相关的吸光度保持接近。相比之下，DAHAEDC 的结合是通过 DA 的伯胺和 HA 的羧基之间的酰胺键形成的。EDC/NHS 偶联后观察到的蓝移反映了多巴胺发色团在酰胺形成后电子环境的变化，这增加了紫外吸收所需的能量。这种类型的蓝移在其他基于儿茶酚的偶联中也已有报道。

PEDOT 涂层的电聚合和电化学表征：
测试电极用电聚合的 PEDOT:PSS、PEDOT:PDA、PEDOT:DAHAEDC 和 PEDOT:DAHANaIO4 进行了涂覆，采用恒电沉积法。对于 PEDOT:PSS，使用了 200 mC cm?2 的最佳沉积电荷密度，这是根据先前文献中的既定协议得出的，对于我们直径为 2 mm 的电极而言相当于 6.28 mC。对于测试用复合材料，我们设计了沉积工艺，以实现视觉上均匀的涂层覆盖度以及与PEDOT:PSS对照组相当的高电化学性能指标。为此，我们确定了最佳的单体浓度，并选择了50 mC的沉积电荷，从而获得了具有类似烧杯内性质的生物电极涂层。该工艺设计的实验结果在补充信息中的图S1和表S1中有所报告。时间-电流沉积曲线显示在图2A中，其中PEDOT:DAHAEDC的恒电位沉积时间明显较长，这可能归因于透明质酸骨架的结构状态导致的质量传输动力学较慢。实际上，NaIO4的氧化会断裂糖苷环中的邻位二醇，这一过程会导致严重的链断裂和分子量显著降低。这种降解会产生低粘度的前体溶液，之前已有相关研究。这一点还通过PEDOT:DAHAEDC相比PEDOT:PDA和PEDOT:DAHANaIO4更低的初始电流增长率以及达到50 mC沉积电荷所需的时间得到了进一步证实。

图2 电聚合、电化学表征和浸泡测试
(A) PEDOT涂层的电流-时间恒电位沉积曲线。
(B) 在[Fe(CN)6]3?/4?电解液中的循环伏安（CV）曲线，扫描速率为100 mV s?1。EIS Bode图：(C) 阻抗模量；(D) 阻抗相位角作为频率的函数（曲线为n = 3个涂层电极的平均值）。
(E) 浸泡在细胞培养基之前和之后的扫描电子显微镜（SEM）图像：分别展示了PEDOT:PSS、PEDOT:PDA、PEDOT:DAHANaIO4和PEDOT:DAHAEDC表面的代表性显微照片（上排为浸泡前，下排为浸泡后）。刻度尺：5 μm。

沉积后，通过对涂层电极和未涂层电极进行循环伏安（CV）和电化学阻抗谱（EIS）分析，提取了典型的神经接口电极电化学指标，如阴极电荷存储容量（CSCc）、电活性表面积（EASA）以及1 Hz和1 kHz下的阻抗模量。提取的值列在表1中。与裸露的Au电极相比，基于PEDOT的涂层的CSCc增加了约12至65倍，这与先前的研究结果一致。同样，EASA（从循环伏安图中的峰值电流ip提取的指标，描述了电极表面可用于电荷传输的有效面积）也增加了约3至14倍。最终，阻抗模量测量显示，1 Hz和1 kHz下涂层电极的EASA分别减少了约450至1,200倍和4至5倍。FRAPID（PEDOT:DAHAEDC）在其他基于PEDOT的涂层中表现最好，如CV扫描中的更高电流响应所示（图2B）。EIS Bode图（图2C和2D）显示，在低频率（1 Hz）下，PEDOT:DAHAEDC和PEDOT:PDA的阻抗最低（约370–374 Ω），这是由于涂层引入了较大的界面电容。而在频率>约10 Hz时，所有PEDOT配方都趋近于相同的电阻平台（约172–187 Ω），这反映了由电解质导电性和电极GSA决定的扩散电阻，所有测试样本的电阻平台相同。相位角图也证实了这一观察结果，即在频率>约10 Hz时，PEDOT涂层的阻抗接近0°。金样本的电阻平台出现3个数量级的频率滞后。EIS谱已进行拟合，相关参数在图S2和表S2中列出。

表1 测试电极和对照电极的电化学性能指标（每种类型3个电极，平均值±标准误差）

总的来说，电化学表征结果证实，所有先进的涂层都相较于未涂层的金电极具有更好的性能，且改进幅度在预期范围内。如先前报道的，PEDOT涂层相比裸露的金电极在电化学性能上的提升可以归因于混合离子-电子导电性与体积电容的共同作用，以及粗糙/多孔的表面形态，这些特性增加了神经接口应用中的有效电活性表面积（EASA）。

通过ATR-FTIR（图S3）也验证了PDA成功掺入基于PEDOT的涂层中。PDA特有的N–H伸缩和O–H振动峰（分别为3,254 cm?1和3,273 cm?1）在PEDOT:DAHAEDC和PEDOT:DAHANaIO4中也可见，其峰位分别为3,342 cm?1和3,237 cm?1。然而，由于这些复合材料同时含有PDA和HA，因此这个宽峰反映了两种组分的共同贡献。相比之下，PEDOT:PDA光谱中3,180 cm?1的宽峰来自PDA。PEDOT:PDA在1,314 cm?1、PEDOT:DAHAEDC在1,354 cm?1、PEDOT:DAHANaIO4在1,347 cm?1处的峰代表PEDOT环间C–C伸缩（纯PEDOT中为1,347 cm?1）、PDA儿茶酚基团的C–O–H弯曲（纯PEDOT中为1,365 cm?1）以及HA的羧酸基团C–O伸缩（纯PEDOT中为1,388 cm?1）的重叠区域。PEDOT中的C–O–C伸缩峰（1,174 cm?1）在PEDOT:PDA、PEDOT:DAHAEDC和PEDOT:DAHANaIO4中也存在，分别对应1,174 cm?1、1,203 cm?1和1,210 cm?1。HA的高强度峰（1,023 cm?1，对应糖苷键的C–O–C伸缩）在PEDOT:DAHAEDC中为1,063 cm?1，在PEDOT:DAHANaIO4中为1,067 cm?1。PEDOT中的C–S伸缩峰分别在991 cm?1、846 cm?1和680 cm?1处出现，在基于PEDOT的复合材料中分别对应961 cm?1、843 cm?1和700 cm?1；在PEDOT:PDA中为980 cm?1、836 cm?1和689 cm?1；在PEDOT:DAHAEDC中为985 cm?1、846 cm?1和696 cm?1。PDA的掺入还通过电聚合后电解质颜色的变化得到进一步确认，从无色变为PDA特有的棕色（图S4）。

结构稳定性和培养基暴露后的表面形变变化
为了评估涂层在细胞培养条件下的结构稳定性，在完全的SH-SY5Y培养基中浸泡7天前后对表面形变进行了观察。表面形变的拓扑变化通过扫描电子显微镜（SEM）成像记录。浸泡前后表面改性的显微照片显示了表面形变和结构稳定性的变化（图2E）。PEDOT:PSS在浸泡前表现出相对光滑和致密的形态，而在培养基中浸泡后显著平滑。相比之下，DA功能化的涂层在浸泡后保持了更明显的多孔、颗粒状和类似花椰菜状的表面特征。此外，PEDOT:PDA和PEDOT:DAHAEDC的表面在浸泡前后都显示出更大的聚集体，表明它们的分层形态在培养条件下保持稳定。PEDOT:DAHANaIO4具有更细小且更均匀的颗粒状多孔结构，在浸泡后也相对稳定。这些观察结果表明，表面功能化影响了初始制造拓扑和在细胞培养基下的结构稳定性，即体外条件的暴露会显著改变表面形变以及细胞的锚定位点的可用性。

接触角测量从每个样本的3个随机区域进行，证实了玻璃盖片表面的亲水性（28.06° ± 1.02°），如图3A和3B所示，细胞可以轻易附着并在此表面上增殖。另一方面，金表面的接触角接近90°（87.73° ± 1.16°），其次是PEDOT:DAHAEDC的71.43° ± 3.32°。其余基于PEDOT的表面之间没有显著差异（PEDOT:PDA 44.2° ± 6.08°、PEDOT:PSS 46.83° ± 5.23°、PEDOT:DAHANaIO4 47.53° ± 12.23°），主要与金和DAHAEDC功能化表面不同。

图3 表面形变
(A) 和 (B) 的润湿性以及 (C) 的轮廓测量数据。润湿性通过测量静态接触角来确定。代表性图像显示了液滴与表面接触时的形状。金表面是所有样本中最疏水的（与所有组别明显不同，除PEDOT:DAHAEDC外），而玻璃是最亲水的（B）。在比较功能化组时，只有添加DAHAEDC显著提高了润湿性。粗糙度（Sa）和总高度（St）的测量显示表面有显著差异，特别是在比较基于PEDOT:PDA的组别时（C）。统计显著性用均值±标准差表示，接触角通过单因素方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定（n = 3个样本），轮廓测量则通过单因素方差分析（ANOVA）和基于分布的Kruskal-Wallis检验及Dunn的事后检验确定（n = 5个样本）。显著性用*p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001表示。

通过轮廓测量评估基底表面拓扑
我们评估了每个样本的5个随机区域（排除了材料制造过程中被遮挡的玻璃和金区域），如图3C所示。材料之间的粗糙度（Sa）没有差异。有趣的是，金溅射使玻璃表面变得更为平坦（0.054 ± 0.04 vs. 0.055 ± 0.00 μm），而添加PEDOT:PSS后表面更加平滑（0.046 ± 0.00 μm）。 dopamine（PDA）基修饰将粗糙度增加到0.145 ± 0.02 μm、0.179 ± 0.05 μm和0.308 ± 0.03 μm。PEDOT:PDA、DAHAEDC和DAHANaIO4的峰分布（偏度，Ssk）和凹坑（峰度，Sku）似乎最高，表明表面形成不均匀。

体外生物相容性评估
为了同时捕捉亚慢性活力反应和早期细胞-材料相互作用，使用两种互补的培养范式评估了SH-SY5Y细胞：7天的活力研究和2天的高密度培养模型，用于结构和分子分析。所有测试表面上都有细胞附着和增殖，使用明场显微镜（图4A）可以观察到细胞在金和PEDOT:PSS上的聚集。DA功能化导致表面变暗，使得观察变得复杂。尽管如此，仍能在金和PEDOT:PSS的方向区域确认细胞的附着和存在，并通过先进的生物成像技术（包括轮廓测量和共聚焦显微镜）进一步可视化。LDH释放的评估（图4B）显示，在7天的测试期间，只有PEDOT:PDA和PEDOT:DAHANaIO4组存在差异。

图4 体外评估
(A) 明场显微镜显示细胞在玻璃、金、PEDOT:PSS和PEDOT:PDA上的附着、增殖和聚集。明场显微镜的局限性使得在所有PDA和DAHA功能化表面难以清晰检测细胞。细胞核呈青色（DAPI），丝状肌动蛋白呈品红色，β3-微管蛋白呈黄色，纤维连接蛋白1（FN1）呈绿色。刻度尺：100 μm。通过双向方差分析（ANOVA）和Tukey的事后检验确定LDH的统计显著性（n = 8；来自2个独立实验的结果），以及基于高斯分布的单因素方差分析（ANOVA）和Kruskal-Wallis检验及Dunn的事后检验确定轮廓测量的统计显著性（n = 10；来自2个独立实验的结果）。显著差异用*p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001表示。

在最初的7天实验中，当接种密度为50,000个细胞/盖片时，PEDOT:PDA上的细胞死亡率相对较高（图4D）。然而，当使用3-5个细胞的小聚集体而不是单个细胞进行更高密度的接种，并且在较短的2天培养周期内，细胞能够在所有表面上附着、增殖并形成聚集体（图5）。

图5 使用Leica的LAS X软件观察3D细胞结构的倾斜情况
在玻璃表面上（顶部行），细胞核（左列）和F-肌动蛋白（右列）在表面上均匀分布。细胞聚集在功能化表面上，细胞核通常位于簇的顶部或侧面（红色-黄色），而F-actin填充了结构并延伸到与表面接触的最低点（绿色到蓝色）。倾斜视图从顶部和底部显示相同区域，分别仅显示细胞核或仅显示F-actin。彩虹色谱代表扫描区域内的垂直位置，红色表示顶部，蓝色表示底部，这是由软件根据扫描区域生成的。彩虹色谱根据每个样本的厚度进行缩放，因此在不同组之间没有标准化。样本厚度从20到36微米不等。

通过对PEDOT表面上细胞组织的轮廓测量评估，由于基底变暗和光学异质性限制了连续的2D分割，因此使用粗糙度（Sa）、总高度（St）、偏度（Ssk）和峰度（Sku）的轮廓测量方法来评估细胞组织，并结合了聚集体的厚度和垂直组织的共聚焦z堆栈分析。这种方法能够捕捉到细胞覆盖表面结构的3D差异，但不能捕捉基于对象的参数，如聚集体数量、圆形度或最近邻距离。表面轮廓测量显示SH-SY5Y细胞覆盖材料的拓扑结构存在明显的基底依赖性差异（图4C）。虽然平均粗糙度在各组之间只有轻微的变化，但总高度在导电基底上通常高于玻璃基底，表明细胞覆盖表面的垂直异质性增加。由于轮廓测量同时反映了底层涂层和上层细胞层的贡献，这些差异可能反映了材料形态和基底依赖性细胞组织的综合作用。高阶粗糙度参数在基底之间的区分度更高。具体来说，裸露的金表面上峰度和偏度显著升高，表明高度分布以明显的峰值为主。这种轮廓与局部细胞聚集或聚集体形成一致，表明与PEDOT涂层相比，表面的组织更加异质。相比之下，PEDOT:PSS、PEDOT:PDA、PEDOT:DAHAEDC和PEDOT:DAHANaIO4的偏度和峰度值相对较低，表明细胞覆盖表面的高度分布更加均匀。

结果表明基底化学性质显著影响SH-SY5Y细胞的组织结构，金促进更异质和聚集的形态，而改性的PEDOT表面，特别是PEDOT:PDA和PEDOT:DAHANaIO，支持更均匀分布的细胞结构。

在高播种密度（80,000个细胞/样本）培养2天后，共聚焦z堆栈的倾斜视图进一步揭示了SH-SY5Y细胞组织的基底依赖性差异（图5）。在玻璃基底上，细胞形成相对均匀且横向分布的层，细胞核和F-actin在表面上均匀分布。相比之下，功能化表面促进了紧密的多细胞簇的形成，这些簇具有明显的垂直组织。在这些表面上，细胞核主要位于簇结构的顶部区域，而F-actin则延伸到簇与基底的界面，表明细胞在聚集体内保持表面附着和细胞骨架的整合。这些结构的厚度约为20-36微米，具体取决于基底，并受到视野的限制。这些结果与轮廓测量结果一致，后者显示PEDOT:DAHAEDC上的总高度增加了近80微米，而裸露的金和功能化表面上的高度分布参数发生了变化。这表明所测试的基底化学性质不仅影响细胞的附着和活力，还影响SH-SY5Y细胞在高密度培养条件下的空间组织和3D生长行为。

我们进一步使用与以下方面相关的选定SH-SY5Y基因表达面板评估了不同功能化PEDOT表面的效果：（1）神经元相关标记物（微管蛋白β-3链TUBB3；胶质纤维酸性蛋白GFAP；脑源性神经营养因子BDNF；神经细胞黏附分子NCAM；真核翻译起始因子4E结合蛋白1EIF4EBP1）；（2）细胞外基质（ECM）组织和细胞黏附（纤维连接蛋白1 FN1；整合素β1 ITGB1；胶原蛋白III型α1链COL3A1；层粘连蛋白VIM）；（3）突触功能（突触蛋白SYP；突触标签蛋白SYT）；（4）细胞间通讯（间隙连接蛋白α1 GJA1；间隙连接蛋白β6 GJB6）。基因表达结果显示在图6中。

图中显示了在玻璃、金和PEDOT功能化表面上培养2天的SH-SY5Y细胞的相对基因表达分析。

总体而言，神经元相关标记物（TUBB3、GFAP、BDNF、NCAM和EIF4EBP1）、细胞外基质组织和细胞黏附标记物（FN1、ITGB1、COL3A1和VIM）、突触相关标记物（SYP和SYT）以及细胞间通讯标记物（GJA1和GJB6）的表达水平被归一化到RPL19，并以相对于在金基底上培养的细胞的倍数变化表示。统计显著性通过单因素方差分析（ANOVA）和基于高斯分布的Tukey或Kruskal-Wallis检验及Dunn事后检验确定。条形图表示几何平均值，单个点代表生物重复实验（n = 3）。显著差异标记为?p ≤ 0.05、??p ≤ 0.01、???p ≤ 0.001。

最显著的基底依赖性差异出现在FN1和GJA1上，其次是SYP、SYT和ITGB1的较大变化。PEDOT:PSS和PEDOT:DAHAEDC上FN1表达的降低可能表明这些表面上的ECM沉积和基质相关组织发生了改变，而在金和PEDOT:DAHANaIO4上FN1表达的增加可能表明ECM相互作用或黏附相关重构得到了增强。GJA1在不同基底上的表达有显著差异，特别是在PEDOT:PSS和PEDOT:DAHAEDC上表达升高。由于GJA1编码参与细胞间通讯的主要间隙连接蛋白connexin 43，这些发现可能反映了这些表面上细胞间连接的增强和簇相关通讯的增强。这种观察与成像数据中观察到的多细胞聚集和垂直组织结构一致。

突触相关标记物SYP和SYT也观察到了中等程度的差异，这可能表明基底对神经元通讯过程有潜在的影响。然而，这些效应不如ECM和连接标记物的效应显著。ITGB1在不同基底上的表达相对一致，仅在PEDOT:DAHANaIO4上观察到轻微增加，表明黏附介导的信号传导有细微差异，而不是细胞附着机制的重大改变。mRNA表达水平的变化表明，不同的表面功能化主要影响SH-SY5Y细胞的组织结构、ECM相互作用和细胞间通讯，而不是诱导神经元相关基因表达的重大变化。尽管FN1通常与组织修复过程中的ECM重塑相关，但COL3A1和VIM的表达相对稳定，这表明观察到的转录变化更符合基底依赖性的细胞-基质相互作用调节，而不是激活更广泛的伤口愈合相关反应。

免疫荧光分析揭示了基底依赖性的细胞组织和黏附相关结构。免疫荧光分析显示，在培养2天后，SH-SY5Y细胞的组织和细胞骨架结构存在基底依赖性差异（图7）。在玻璃基底上培养的细胞显示出更分散的生长模式和更广泛的表面覆盖，而在金和PEDOT功能化表面上促进了紧密的多细胞聚集体的形成。F-actin和β3-tubulin的组织遵循这些聚集结构的布局，β3-tubulin阳性的细胞延伸从多细胞聚集体跨越所有测试的表面。

在玻璃基底上培养的细胞均匀分布，而在改性表面上聚集，包括金。细胞核呈白色（DAPI），丝状actin（F-actin）呈青色，β3-tubulin（B3T）呈黄色，纤维连接蛋白1（FN1）或层粘连蛋白（Vin）呈品红色。比例尺：100微米。β3-tubulin的染色在所有基底上保持一致，展示了神经元相关的细胞骨架组织。金和PEDOT:PDA表面显示出特别紧密和密集组织的β3-tubulin阳性聚集体，而PEDOT:DAHAEDC和PEDOT:DAHANaIO4显示出从聚集体延伸出的更广泛的突出结构。FN1的染色集中在多细胞结构周围，而不是在基底表面广泛分布；这表明与簇形成相关的基底依赖性ECM组织（图7A）。此外，层粘连蛋白（VIN）的染色进一步揭示了不同基底之间的焦点黏附相关组织的差异，特别是在金、PEDOT:PSS和PEDOT:PDA表面上观察到更强和更有组织的层粘连蛋白阳性结构，表明这些涂层上的黏附相关细胞骨架组织得到了增强（图7B）。

这些结果也与轮廓测量（图4C）和倾斜重建分析（图5）一致，后者显示功能化表面上的垂直组织和紧密的多细胞聚集比在玻璃表面上观察到的更广泛和更均匀的分布更为明显。结合qPCR的结果，这些结果表明表面功能化主要影响SH-SY5Y的细胞骨架组织、多细胞聚集、ECM相关重构和焦点黏附相关结构，而不是诱导神经元相关基因表达的重大变化。

先进神经界面材料的发展传统上是由电化学性能的改进推动的（例如，用于神经生理记录和神经刺激），包括增加的CSC、降低的阻抗和大的CIC。然而，应用研究中仍然存在一个关键的长期可靠性差距，目前尚未解决。我们认为要弥合这一差距，必须更好地理解神经界面与细胞之间的相互作用机制。将先进的神经界面材料成功转化为可植入的神经电子设备需要一个分阶段的评估策略，其中控制的体外筛选补充而不是替代体内研究。体外模型能够在定义的条件下可重复地比较材料配方，并提供对选定细胞-材料相互作用的机制洞察。然而，体内研究对于评估整合的炎症和胶质反应、血管和多细胞组织相互作用、慢性异物反应以及设备功能仍然是不可或缺的。

在这里，我们将我们的多模态平台定位为一种中间筛选方法，以识别依赖于涂层的细胞反应，并优先考虑候选材料，以便在更具生理代表性的模型和体内研究中进行后续评估。以功能化的PEDOT涂层作为测试案例，我们将传统的生物相容性测量与定量的形态学、3D结构和分子分析结合起来。尽管所有测试的电极表面都支持SH-SY5Y细胞的存活和附着，但它们引发了不同的细胞反应，这些反应仅通过生存力测定是无法发现的。一个值得注意的观察是传统细胞毒性测定与更详细的结构和分子表征技术之间的差异。LDH测定显示所有测试基底上的细胞相容性良好，表明没有涂层引起显著的急性毒性。然而，轮廓测量、共聚焦重建、免疫荧光成像和基因表达分析揭示了细胞组织、多细胞聚集、ECM相关重塑和细胞间通讯的显著差异。这些发现突显了在神经界面开发过程中仅依赖代谢或生存力测定所带来的重要局限性。因此，尽管这样的测定对于识别明显细胞毒性的材料仍然至关重要，但它们仅提供了关于细胞与生物电极表面相互作用的有限信息，因此可能低估了生物学上相关的基底依赖性效应。

观察到的差异可能与表面功能化引入的不同物理化学性质有关。已知表面润湿性、粗糙度和微观结构稳定性会影响蛋白质吸附、细胞附着、细胞骨架组织和ECM沉积。多巴胺功能化的PEDOT涂层与标准PEDOT:PSS相比表现出显著不同的地形特征，包括在长时间培养条件下更大的粗糙度和保持多孔微观结构。这些差异伴随着SH-SY5Y组织的变化，特别是在功能化表面上形成了紧密的多细胞聚集体和增加的垂直生长。3D重建显示，在玻璃基底上培养的细胞形成了相对均匀的层，而在金和PEDOT功能化基底上促进了达到大约80微米厚的垂直组织细胞结构的发展。这些观察表明基底化学不仅影响细胞附着，还影响这种神经元样细胞模型中的空间组织。

免疫荧光分析进一步支持了这一解释。虽然所有基底上的β3-tubulin表达和组织都保持一致，表明保存了神经元相关的细胞骨架特征，但在纤维连接蛋白和层粘连蛋白的分布上观察到了显著差异。纤维连接蛋白在多细胞聚集体周围的定位表明了基底依赖性的ECM组织，而层粘连蛋白免疫染色的变化表明了焦点黏附相关组织的差异。结果表明，测试涂层的主要生物学效应不是诱导重大的表型变化，而是调节影响SH-SY5Y细胞群体在材料表面的细胞-材料和细胞-细胞相互作用。

基因表达结果与这些结构观察结果一致。神经元相关标记物（包括TUBB3、GFAP、BDNF、NCAM、EIF4EBP1和GJB6）的表达在所有测试基底上保持相对稳定，表明涂层没有显著改变神经元相关的转录程序。这可能表明改良后的PEDOT表面能够与类神经细胞保持兼容性，同时影响这些细胞如何组织及其与微环境的互动。基因表达分析进一步显示，与细胞外基质（ECM）相互作用和细胞间通讯相关的选定转录本发生了底物依赖性的变化，但对评估的与神经细胞相关的标记物只有有限的影响。包括TUBB3、GFAP、NCAM、BDNF和EIF4EBP1在内的与神经细胞相关标记物的表达相对稳定，表明所有PEDOT涂层在这些实验条件下都能保持细胞的兼容性，而不会显著改变这些标记物的表达。相比之下，FN1和GJA1的差异性调控表明了细胞-基质和细胞-细胞相互作用的底物依赖性调节。在某些PEDOT配方上，GJA1表达的增加可能反映了通过间隙连接介导的通讯增强，这与显微镜观察到的多细胞聚集体和垂直组织的细胞结构一致。同样，FN1表达的变化表明了ECM组织和粘附相关重塑的差异。值得注意的是，这些变化发生在COL3A1和VIM表达没有显著变化的情况下，说明观察到的响应并不代表更广泛的伤口愈合或间充质样转录程序的激活。相反，数据支持这样的解释：表面功能化主要调节局部组织和粘附过程，而不是诱导重大的表型转变。此外，除了本研究调查的PEDOT涂层的具体发现之外，这项研究还强调了神经接口开发中的一个更广泛挑战。尽管在材料工程和表征方面取得了显著进展，但新型生物电极材料的生物学验证仍然严重依赖于动物研究。尽管体内模型对于确认长期组织反应和设备功能是不可或缺的，但它们与较高的成本、较低的通量和伦理挑战相关。因此，在进行动物测试之前，迫切需要能够在体外方法上提供更多关于细胞-材料相互作用的机制性见解。最近在空间转录组学、单细胞测序和类器官技术方面的进展为研究神经组织与设备相互作用提供了高通量的机会。然而，将这些方法直接应用于植入的神经接口并不简单。空间转录组学方法通常需要在设备取出后对组织进行切片，这可能会破坏关键的电极-组织界面，并使直接与材料表面接触的细胞识别变得复杂。同样，尽管基于类器官的模型可能更准确地再现组织结构和神经网络形成的某些方面，但它们本身并不提供关于生物电极整合、粘附动态或电化学功能的信息。这里提出的多模态框架解决了这一空白，整合了多个生物学尺度上的互补测量。该框架不仅仅依赖于生存率或转录组学终点，而是结合了定量形态学、3D组织学、免疫细胞化学和靶向分子分析，以生成对生物电极材料细胞反应的更全面了解。重要的是，本研究中识别出的几种底物依赖性效应仅通过传统的细胞毒性测试是无法检测到的。这展示了未来的神经接口材料评估流程如何从类似的综合评估策略中受益。我们这种整合了互补的结构、形态和分子表征技术的多模态评估框架的一个主要优势是，我们的发现跨不同方法是一致和协调的，这进一步强化了表面功能化主要影响细胞组织、ECM相互作用和细胞间通讯的解释。此外，通过结合3D重建和倾斜可视化分析来评估相对于材料表面的细胞组织，克服了传统终点成像的局限性，后者通常依赖2D投影，因此可能会掩盖底物依赖性的细胞组织差异。通过将轮廓测量与基于共聚焦的3D重建结合，我们能够可视化并比较不同基底上SH-SY5Y细胞群体的空间结构。这揭示了簇形成、细胞分布和聚集物厚度的差异。重要的是，倾斜可视化使我们能够评估细胞-材料界面和多细胞结构的顶表面，从而评估整个细胞聚集物厚度中的核和细胞骨架组织的空间分布。这种方法直接揭示了表面功能化不仅影响细胞对基底的附着，还影响界面上方细胞的3D组织，补充了从基因表达分析中获得的分子结果。在未来研究中，将标准化2D和3D图像分割方法与轮廓测量相结合，可以提供关于聚集物大小、数量、形状和空间分布的额外定量测量。最后，本研究设计还包括了对电极预处理和孵育后SEM表征。植入后，电极表面会迅速受到周围组织生物环境的影响，从而在稳定的细胞-材料相互作用发生之前对其进行评估。因此，在暴露于培养基后评估涂层形态提供了更具有生物相关性的界面表示，并确认了结构稳定性方面的底物依赖性差异。结合基于共聚焦的3D重建，这使得能够在实际呈现给细胞的表面状态背景下解释细胞反应。当前的研究实践通过“全面”的体内生物相容性和功能性研究投入了大量资源，并带来了相当大的财务和伦理负担，这些研究通常是在新材料的细胞毒性筛查成功之后进行的。更有信息量的体外测试可以通过控制材料配方的比较和揭示仅通过生存率测定无法捕捉到的细胞反应来补充这些研究。在这里，具有相似生存率结果的涂层对SH-SY5Y细胞的组织、粘附、ECM相关结构和选定的转录反应产生了不同的影响。因此，这种多模态平台旨在作为一种中间筛选工具，以支持候选材料的优先排序，并指导后续在更复杂的体外和体内模型中的测试。未来应用这一框架可能有助于澄清材料属性与细胞反应之间的关系，并更好地指导神经接口材料的设计。

**研究的局限性**
由于SH-SY5Y细胞不能再现神经组织的表型和功能复杂性，我们的发现应被解释为在这种特定的体外细胞模型中的相对反应，而不能作为体内神经整合的直接证据。实验是在2天和7天的短培养期内进行的，因此仅捕获了细胞对测试材料的早期反应。本研究没有包括定量形态学指标、长期降解动力学和详细的机械表征，这些是未来的重要方向。分子分析仅针对一组选定的基因进行，这些基因用于探测神经表型、ECM组织、粘附、突触功能和细胞间通讯。为本研究选择的电极材料组合展示了我们多模态方法的价值，揭示了仅通过标准测定无法发现的底物依赖性的细胞组织差异。然而，精确识别不同功能化分子的作用超出了本研究的范围，将需要针对性的研究。

**资源可用性**
有关更多信息和资源的请求应联系首席联系人Giuseppe Schiavone（[e-mail]）。

**致谢**
作者感谢欧盟CHIPS JU Horizon 2020项目（授权协议编号101112347，项目NerveRepack）和挪威研究委员会（Norway）通过Micro- and Nano-Fabrication Facility（项目编号322552和NORFAB IIIb）的资助。

**作者贡献**
概念化：A.S.和G.S.；方法学：S.S.、J.H.、A.S.和G.S.；写作-原始草稿和写作-审阅和编辑：S.S.、J.H.、A.S.和G.S.；调查和验证：S.S.、J.H.和A.S.；资金：A.S.和G.S.；监督：A.S.和G.S.；资源：A.S.和G.S.

**利益声明**
作者声明没有竞争利益。

**关键资源表格**
**试剂或资源**
**来源标识符**完全溶解后，向HA溶液中加入了1 mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（Sigma Aldrich，EDC）和1 mM N-羟基琥珀酰亚胺（Sigma Aldrich，NHS）。25分钟后，再加入1 mM 多巴胺盐酸盐（Sigma Aldrich，DA），后者预先溶解在2 mL 醋酸缓冲液（pH 4.5）中。溶液在黑暗条件下、氮气氛围中磁力搅拌过夜。随后将溶液用酸化去离子水（pH 4）进行2天透析。透析完成后，溶液在真空条件下脱气40分钟，然后进行冷冻干燥，干燥后的DAHA产物储存在-20°C直至进一步使用。

通过HA氧化合成：该合成方法遵循先前描述的方案。简而言之，将10 mg/mL HA和5 mg/mL 过氧酸盐（NaIO4）加入pH 5的1×磷酸盐缓冲盐水（PBS，ThermoFisher Scientific）中，避光条件下完全溶解5小时。向混合物中加入1% v/v 乙二醇，中和未反应的过氧酸盐1小时。溶液用去离子水透析2天后进行冷冻干燥。干燥后的产物（10 mg/mL）重新溶解在PBS（pH 5）中。溶解完成后，加入10 mg/mL DA，在室温下避光反应10小时，再次进行冷冻干燥，随后储存在-20°C直至进一步使用。

电聚合：电聚合沉积在三电极电池中进行，使用银/氯化银参比电极、2 cm2 网孔铂对电极以及之前描述的金工作电极，在CH Instruments（CHI660E）恒电位仪的连续磁力搅拌（200–300 rpm）下进行。对于PEDOT:PDA涂层，将1 mg/mL DA溶解在9 mL PBS（pH 7.2）中，将10 mM 3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT，Sigma Aldrich）溶解在1 mL 乙二醇中。两种溶液混合后用漩涡器处理，并用氮气冲洗10分钟，遵循先前描述的方案。对于PEDOT:DAHA涂层，分别将DAHAEDC和DAHANaIO4前驱体溶解在9 mL PBS中，浓度分别为1 mg/mL和2 mg/mL。将20 mM EDOT溶解在1 mL 乙醇中。混合后用漩涡器处理并用氮气冲洗10分钟，然后进行电沉积。对于PEDOT:PSS，将10 mM EDOT和25 mM 聚（4-苯乙烯磺酸）钠（PSS，Sigma Aldrich）混合在10 mL去离子水中。电聚合通过在恒电位下沉积进行，PDOT:PDA和PEDOT:DAHAEDC的沉积电荷达到50 mC，PEDOT:PSS的沉积电荷达到6.28 mC。在体外电极上，沉积电荷分别调整为1C（PDOT:PDA和PEDOT:DAHAEDC）和150 mC（PEDOT:PSS）。

电沉积后，电极浸入乙醇中5至10分钟以去除未反应的EDOT，彻底用去离子水冲洗后风干。

电化学表征：CV和EIS测量在三电极电池中进行，使用CH Instrument恒电位仪。CV测量在含有2 mM 六氰合铁酸盐（[Fe(CN)6]3?/4?，Sigma Aldrich）的0.1 M 氯化钾（Sigma Aldrich）溶液中进行，扫描速率为100 mV s?1，电压范围为-0.6 V–0.8 V。为了平衡电化学系统，在捕获最终伏安图之前进行五次连续扫描。EIS测量在PBS中进行，采用10 mV正弦电压幅度，无直流电位（相对于开路电位为0 V），频率范围为1 Hz–100 kHz。阴极储电容量（CSCc）通过积分循环伏安图的阴极（负）部分面积计算，然后根据电极的几何表面积和扫描速率进行归一化，具体方法见公式1。此积分是在CV测量扫描的最后一个循环中使用自定义Python脚本数值计算的。

??????????=(?????????1·???1)·????????∫???????????(??)????（公式1），其中GSA是几何表面积，ν是扫描速率（V s?1）。

EASA通过CV扫描使用简化的Randles-?ev?ík公式计算：????=(2.69×105)·??32·??·??12·??·??12???=????(2.69×105)·??32·??12·??·??12（公式2），其中ip是氧化还原峰电流（A），n是参与氧化还原反应的电子数（n = 1），A是电化学表面积（cm2），D是[Fe(CN)6]3?/4?氧化还原探针在KCl溶液中的扩散系数（等于7.6 × 10?6 cm2 s?1），C是[Fe(CN)6]3?/4?的浓度（摩尔浓度为2 × 10?6 mol cm?3），ν是扫描速率（V s?1）。

电极预处理：电极在37°C的培养基中预处理7天，以模拟细胞孵育和免疫荧光处理的条件。扫描电子显微镜（SEM）成像前的后处理包括：首先浸泡在4% 巴弗福尔马林（PFA）中10分钟，然后在甘氨酸（0.1M，pH 2.2，G8898，Sigma-Aldrich）中浸泡15分钟，接着连续三次用PBS清洗10分钟。表面修饰的地形变化通过SEM成像记录。

化学分析：使用ATR-FTIR光谱仪（Nicolet iS50，ThermoFisher）在500–4000 cm?1波数范围内对干燥的前驱体、粉末HA和DA进行分析。纯PEDOT粉末通过EDOT的自聚合合成，该方法基于先前报道的方案：将EDOT（114 μL）溶解在乙醇（4 mL）中，然后加入甲酸（9.4 mL）。混合物密封以防止溶剂损失，并在室温下聚合3周。所得溶液转移到Petri皿中并在室温下空气干燥。完全干燥后，将PEDOT薄膜从玻璃基底上刮下并进一步干燥。纯PDA粉末通过将多巴胺（500 mg）溶解在1 M NaOH（3 mL）中制备；溶液倒入Petri皿中并在40°C下干燥至完全蒸发。对于基于PEDOT的复合材料，薄膜通过电沉积在镀金Kapton薄膜上（使用与电极相同的溅射条件）。这种柔性基底确保与ATR-FTIR检测器良好接触，从而实现准确测量。

UV-Vis光谱分析：将DAHA前驱体、DA和HA溶解在pH 3的去离子水中，浓度分别为0.25 mg/mL（DAHA）、1 mg/mL（HA）和100 μg/mL（DA）。样品在250–310 nm波长范围内进行分析。

润湿性评估：使用接触角测量仪（OCA-20，DataPhysics Instruments GmbH，德国）通过静态接触角测量评估表面的润湿性，根据切线（接触角<30°）、椭圆（30° < 接触角 < 90°）或Young–Laplace（接触角 > 90°）拟合在室温下进行。使用的润湿剂为2 μL超纯水（VWR，挪威奥斯陆），数据采集使用SCA20 V.3.7.4软件（DataPhysics Instruments GmbH，德国）。每个测试组每个样品进行三次测量。

表面形貌评估：使用Light laser NEOX非接触式3D表面轮廓仪（Sensofar-Tech S.L., Terrassa, Spain）进行表面形貌分析，配备×20倍EPI（Nikon，东京，日本）共聚焦物镜，每个观察区域的分辨率为875.01 μm × 658.83 μm，放大倍数为20倍。图像由SensoSCAN版本6.7（Sensofar-Tech S.L., Terrassa, Spain）采集，数据处理使用SensoMAP Standard版本7.3软件（Sensofar-Tech S.L., Terrassa, Spain）。每个测试组随机选取五个区域进行表面变化分析。样品在30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中分别脱水处理15分钟，以评估细胞-表面相互作用。

体外评估：电极放入24孔板中，用70%乙醇消毒15分钟，然后用无菌PBS冲洗3次，每次1分钟，每次用完全的基础培养基冲洗1分钟，并在空气中消毒过夜（19小时）。细胞在室温下静置1小时。神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞用Trypsin-EDTA（1×，392–43；VWR International bv，比利时）处理后计数，使用Countess 3（Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国）接种到每个孔中，每个孔接种50,000个细胞，随后加入300 μL培养基至最终体积400 μL。在D1（ halfway）、D4（完全）和D7（完全）时间点收集细胞培养基。样品还用4% PFA固定在室温下15分钟以进行免疫荧光和表面形貌分析。

首先进行了为期7天的培养实验，每个样品接种密度为50,000个细胞，以评估细胞的附着、存活率、增殖和随时间的表面定植情况。随后进行了为期2天的短期培养实验，接种密度更高（每个样品80,000个细胞），以详细评估细胞组织结构、三维结构、免疫荧光染色和基因表达反应。

细胞毒性评估：根据制造商的指南（11644793001，Roche，瑞士）测量细胞培养基中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。工作溶液在测试前新鲜配制，以1:1的比例加入解冻后的细胞培养基中，在摇床上低速旋转培养30分钟，并在室温下避光。在BioTek ELx800吸光度微板读数仪（BioTek，VT，美国）上于490 nm处测量吸光度。细胞培养基中的LDH活性值与在镀金基底上生长的细胞的结果进行归一化。

免疫荧光分析：将细胞以50,000个细胞的密度接种在样品上，并培养7天（D7）。在实验时间点，样品先用4% PFA固定15分钟，然后用PBS清洗三次。细胞用0.1% Triton X-100渗透15分钟。细胞用1% 牛血清白蛋白（BSA）在PBS中封闭1小时，然后与一抗（vinculin，M，V9131，SigmaAldrich，MA，美国）、β III微管蛋白（Rb，ab18207，Abcam，英国）和β III微管蛋白（M，sc-80005，Santa Cruz，美国）孵育1小时。样本用PBS清洗三次后，与荧光标记的二抗（山羊抗小鼠Alexa 488和驴抗兔Alexa 568，A32723，A10042，Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国）孵育。样品用PBS清洗三次后，与荧光标记的二次抗体孵育。

膜蛋白L19（RPL19）的表达量通过-qPCR方法进行定量，使用随机六聚体作为引物。所有实验的三个技术重复样本的RPL19 Ct值相互比较，以评估技术重复性和不同基底之间的差异。RPL19 Ct值在技术重复样本之间高度一致，范围为20.69至21.83；组平均Ct值范围为20.84至21.59。

电聚合和电化学表征均在三个重复样本上进行。体外实验在三个独立实验中各自进行三次重复。通过方差分析（ANOVA，GraphPad Prism 10，美国加州）来估计可量化参数之间的统计学显著差异，并在数据符合正态高斯分布的情况下设定95%的置信区间，随后使用Tukey事后检验进行组间比较；对于不符合正态高斯分布的数据，则采用极值（min–max）方法、z25%和z75%方法以及非参数Kruskal-Wallis检验并辅以Dunn的事后检验。当涉及两个变量时，使用双向方差分析（two-way ANOVA）进行检验。统计学显著性分别用?p ≤ 0.05、??p ≤ 0.01和???p ≤ 0.001表示。共聚焦显微镜图像使用FIJI软件进行处理，并采用Z投影方式进行处理以备发表；图像生成过程则使用Leica的LAS X软件完成。补充信息（1）PDF格式（11.10 MB），文件名为S1。内容包括图S1–S7、表S1–S3、方法S1和S2。