成人锂肝素血浆钾参考区间的建立

《Diagnostics》：Establishment of Reference Intervals for Lithium Heparin Plasma Potassium in Adults

　　

背景/目的：在我国现行临床实践中，依据血清标本建立的钾参考区间被常规同时应用于血清分离胶管进行的常规生化检测与采用锂肝素血浆进行的急诊生化检测。本研究旨在依据中国卫生行业标准WS/T 402-2024，通过间接离子选择电极（ISE）法建立血浆特异性钾参考区间。方法：自中国人民解放军总医院健康体检人群采集296份配对血浆与血清样本。采用Roche cobas 8000模块化分析仪系列的ISE模块测定钾浓度。采用Wilcoxon符号秩检验与Bland–Altman分析比较两种标本类型，并采用非参数法确定血浆钾参考区间。结果：血清钾浓度显著高于血浆钾水平（中位差值：0.23 mmol/L；Z = ?13.96；p < 0.001）。统计分析提示血浆钾参考区间应按性别分层。成年男性血浆钾参考区间为3.21–4.72 mmol/L，成年女性为3.21–4.51 mmol/L。结论：血浆与血清钾水平存在系统性偏倚。回顾性分析显示，将源自血清的参考区间应用于血浆钾结果，可导致16.97%的急诊血浆钾测定结果被重新分类。本研究建立的性别特异性血浆钾参考区间为急诊及围手术期血浆钾结果判读提供了更可靠的依据。

研究背景方面，钾是维持人体内环境稳态的关键电解质，也是细胞内含量最丰富的阳离子。健康成人总体钾约3500–4500 mmol，约98%位于细胞内，约2%位于细胞外。细胞外钠浓度为140–150 mmol/L，而细胞外钾浓度仅为3.5–5.5 mmol/L，这种跨膜离子浓度梯度主要依靠Na+/K+-ATPase（钠钾泵）的主动转运维持，构成神经传导、心肌收缩与骨骼肌功能的基础。由于钾对细胞膜电位的决定性作用，血清钾浓度的轻微偏离即可产生严重临床后果。流行病学证据显示血钾水平与全因死亡及心血管死亡呈U形关联，风险最低点约在4.2 mmol/L；高钾血症可显著增加心血管疾病患者死亡风险。因此，准确测定血钾是急诊、围手术期及重症监护临床决策的重要依据。该院急诊科承担大量手术病例，临床医师评估患者钾状态所依赖的急诊生化结果主要来自锂肝素血浆标本。使用锂肝素血浆具有两方面优势：其一，可快速分离血浆，避免凝血过程中血小板与红细胞释放钾的干扰，使钾测定更接近体内水平；其二，可有效缩短实验室周转时间，满足急诊快速筛查需求。多项研究已证实血清钾浓度显著高于血浆钾浓度，差异主要归因于凝血过程中血小板与血细胞释放钾。然而在我国现行临床实践中，依据血清建立的钾参考区间被普遍同时应用于血清分离胶管采集的血清标本（常规生化检测）与锂肝素血浆标本（急诊生化检测）。这一做法存在明确临床风险：以血清来源参考区间评价血浆钾结果可能导致对患者钾状态的低估，从而误导临床决策，可能延误急诊手术干预并影响患者结局。因此有必要建立专门的血浆钾参考区间。目前检测采用Roche cobas 8000模块化分析仪系列ISE模块的间接离子选择电极（ISE）法。该检测的制造商说明书（IFU）分别给出源自西方人群的血清与锂肝素血浆钾参考区间（分别为3.5–5.1 mmol/L与3.4–4.5 mmol/L），均引自Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry第5版（2001）。在我国，现行国家行业标准WS/T 404.3-2012推荐血清钾参考区间为3.5–5.3 mmol/L；Jia等纳入4524名健康汉族成人的研究报告区间为3.6–5.2 mmol/L；该实验室历史上采用源自国内教科书的3.5–5.5 mmol/L区间，同样针对血清钾。上述来源均未规定锂肝素血浆钾的参考限。目前我国尚无血浆钾参考区间的国家行业标准。依据中国卫生行业标准WS/T 402-2024，本研究旨在建立离子选择电极法测定锂肝素血浆钾的参考区间，为急诊与临床生化检测提供更准确的判读依据。

研究人员依据WS/T 402-2024与EP28-A3c指南，选取在该院健康体检中心体检的成人作为参考个体。初步纳入416名18–84岁参考个体，其中男性215名、女性201名，按10岁年龄区间分布相对均衡。纳入标准为：近期无疾病诊断；无急性或慢性感染、血液系统疾病、心脑血管疾病、代谢性疾病或恶性肿瘤；既往6个月内无手术史且既往2周内无用药；近期无献血或输血史；女性目前非妊娠或哺乳期。常规生化检测结果异常（包括肝肾功能、同型半胱氨酸及甲状腺功能）者，以及可见溶血、黄疸或脂血的样本予以排除。最终纳入296名受试者（男148名、女148名）建立参考区间。检测在cobas 8000模块化分析仪系列（Roche Diagnostics，Rotkreuz，瑞士）ISE模块上进行，配合cobas p 671医用离心机与cobas p 701后处理系统。采血管为5 mL血清分离胶真空管（13 × 100 mm）与3 mL锂肝素真空管（13 × 75 mm）（Greiner Bio-One GmbH，Kremsmünster，奥地利）。本研究所用锂肝素管均为内壁喷涂干燥锂肝素粉末而非液体抗凝剂，故抗凝剂所致标本稀释可忽略，锂肝素血浆样本可近似反映体内钾浓度。钾离子（K+）浓度采用间接离子选择电极（ISE）法测定。研究前生化分析仪经过常规维护与校准，采用配套高低值质控物进行常规室内质控，研究期间所有质控结果均在Westgard规则规定的可接受范围内。依据行业标准WS/T 408-2024在该实验室两个浓度水平验证钾检测的精密度：水平1（均值 = 3.526 mmol/L）：批内CV = 0.25%，室内总CV = 1.73%；水平2（均值 = 6.051 mmol/L）：批内CV = 0.23%，室内总CV = 0.29%。研究样本分多批次检测，每批次进行校准与室内质控以确保分析性能一致。对全部416名参考个体空腹静脉血同时采集至锂肝素管与血清分离胶管。采集后2 h内以2300× g离心7 min分离血浆与血清，随后立即在分析仪上测定钾。统计分析以完全匿名方式进行。本研究经中国人民解放军总医院伦理委员会批准（批准号S2024-596-01）。统计分析采用SPSS 27.0进行。对同一受试者血浆与血清钾浓度进行配对比较。由于差值呈非正态分布（Shapiro–Wilk检验：W = 0.92，p < 0.001），配对比较采用Wilcoxon符号秩检验。非正态分布数据以中位数（四分位距）[M (P25–P75)]表示，p < 0.05为差异有统计学意义，显著性水平设为α = 0.05。采用Spearman秩相关分析评估两种标本类型的相关性，r > 0.75提示具有相关性。采用Bland–Altman法评估两种标本类型的一致性，计算平均偏倚与95%一致性界限（LoA）。参考区间按WS/T 402-2024规定的标准程序建立：（1）绘制浓度与年龄散点图，直观评估性别与年龄组间差异并识别极端离群值；（2）采用标准正态偏差检验评估性别差异并确定是否需要分区；（3）采用Dixon法识别与处理离群值；（4）采用非参数百分位法确定参考区间，以第2.5百分位为下限、第97.5百分位为上限；（5）采用bootstrap法计算参考限的90%置信区间。

研究结果方面，第一，血浆与血清标本钾的比较及偏倚分析。采用分析仪测定同一受试者配对血浆与血清标本钾浓度。血清钾显著高于血浆钾，差异有统计学意义（p < 0.01）。进一步采用Bland–Altman法进行一致性分析。血清与血浆钾中位差值为0.23 mmol/L（95% CI：0.20–0.25 mmol/L），95%一致性界限为?0.15–0.61 mmol/L。由于平均差值的95% CI不包含零，两种标本类型间存在系统偏倚，提示二者不可互换。两种基质中均观察到性别相关差异，男性钾浓度始终高于女性。男性血浆钾均值为3.96 mmol/L，女性为3.82 mmol/L（均值差：0.14 mmol/L；中位差：0.13 mmol/L；p < 0.001）。男性血清钾均值为4.17 mmol/L，女性为4.07 mmol/L（均值差：0.09 mmol/L；中位差：0.11 mmol/L；p = 0.002）。进一步对血浆与血清数据进行偏倚分析。依据中国卫生行业标准（WS/T 403-2024）规定的允许偏倚（B%）及该实验室质量要求，钾的偏倚超出允许范围，血清钾浓度始终高于血浆钾浓度。第二，血浆钾参考区间的建立。血浆钾与年龄呈弱正相关（Spearman ρ = 0.223，p < 0.001），每十年增加+0.038 mmol/L（95% CI：0.013–0.063）。男性相关性较强（ρ = 0.285，p < 0.001；每十年+0.050 mmol/L），女性较弱（ρ = 0.186，p = 0.024），女性回归斜率无统计学意义（每十年+0.023 mmol/L，95% CI：?0.009–0.055；p = 0.16）。Harris–Boyd检验（z = 1.85和0.76 vs. z* = 2.36）不支持参考区间按年龄分区。随后采用标准正态偏差检验（Z检验）评估性别差异并确定是否需要分区，z = 3.94，z* = 3.33，因z > z*，故按性别分区适当。随后通过目视检查与Dixon法识别离群值。测定值按升序排列，计算极差R（最大值与最小值之差），再计算各极端值与其最近邻值之差D；若D/R ≥ 1/3，则该极端观测值视为离群值。男性R = 2.47，两个D值分别为0.51与0.10；女性R = 1.78，两个D值分别为0.18与0.04。所有D/R比值均小于1/3，提示两组均无离群值。依据WS/T 402-2024推荐，采用非参数法确定参考区间，下限与上限分别取第2.5与第97.5百分位，参考限的90%置信区间采用bootstrap法计算。第三，新建立参考区间对急诊血浆钾结果分类的影响。为进一步评估新建参考区间的临床实用性并评价若采用血浆特异性区间常规报告结果将如何变化，研究人员回顾性分析了该院38天内急诊生化检测的36555份锂肝素血浆钾测定结果（男20864份、女15691份）。所有结果改用性别特异性血浆参考区间（男：3.21–4.72 mmol/L；女：3.21–4.51 mmol/L）而非现行采用的血清来源区间（3.5–5.5 mmol/L）重新分类。由于两性血浆区间下限相同，低值不一致区共用：3960份测定（占全部结果10.83%）钾浓度在3.21–3.50 mmol/L，按血清区间归类为低钾血症，而按新血浆区间则落在参考范围内。高值不一致区呈性别特异性：男性20864份中1062份（5.09%）在4.72–5.50 mmol/L，女性15691份中1182份（7.53%）在4.51–5.50 mmol/L，合计2244份（占全部结果6.14%），在血清参考范围内但按新血浆区间将被归类为高钾血症。总体而言，若应用新建立的区间，16.97%的急诊血浆钾结果将被重新分类。由于个体患者真实钾状态缺乏独立参考标准，该分析旨在描述现有报告分类的变动，而非确定哪种分类更准确。

关键技术方法方面，研究人员以健康体检人群建立参考个体队列（中国人民解放军总医院健康体检中心，最终纳入296名，男148名、女148名），采用Roche cobas 8000模块化分析仪系列ISE模块以间接离子选择电极（ISE）法测定配对血浆与血清钾，按WS/T 402-2024与EP28-A3c程序，结合标准正态偏差检验、Dixon法、非参数百分位法与bootstrap法建立参考区间，并以Wilcoxon符号秩检验与Bland–Altman分析进行方法学比较。

讨论部分总结如下。钾作为细胞内液最丰富的阳离子，对维持细胞膜电位、调节神经肌肉兴奋性及维持心脏电生理功能具有重要作用。准确测定血钾浓度对临床诊疗决策意义重大，尤其在急诊手术术前评估中。本研究结果显示锂肝素血浆钾与血清钾存在显著差异，血清钾浓度明显高于血浆钾浓度，且该差异超出临床可接受范围，提示现行血清钾参考区间不适用于血浆钾结果判读。依据WS/T 402-2024，本研究首次在中国人民解放军总医院健康体检人群中建立离子选择电极法测定锂肝素血浆钾的参考区间，结果显示按性别分层后男性血浆钾参考区间为3.21–4.72 mmol/L，女性为3.21–4.51 mmol/L。关于血清–血浆钾差异的机制解释与定量评价，已知血清与血浆钾差异主要源于血液凝固过程中的离体事件。血清制备时血液需室温静置30–60 min以完成凝固，期间血小板活化破裂释放细胞内钾离子，红细胞亦可通过持续代谢不断释放少量钾，最终导致血清钾浓度高于血浆。相比之下，锂肝素血浆可在采血后数分钟内离心分离，有助于最大限度减少离体细胞代谢对钾浓度的影响，更接近体内钾水平。本研究配对样本分析显示血清钾浓度显著高于血浆钾浓度（中位差：0.23 mmol/L；Z = ?13.96；p < 0.001）。Bland–Altman一致性分析进一步揭示两种标本类型间存在系统偏倚（平均偏倚 = 0.23 mmol/L；95%一致性界限：?0.15至0.61 mmol/L），超出基于个体内生物学变异制定的钾允许偏倚标准。上述定量结果共同表明血清钾参考区间不适用于锂肝素血浆钾结果判读，凸显了建立血浆钾基质特异性参考区间的必要性。关于血浆钾参考区间的性别差异，本研究采用标准正态偏差检验（Z检验）分析血浆钾参考区间的性别差异，男女间差异有统计学意义（p < 0.05）。依据WS/T 402-2024，当参考区间存在性别差异但其临床意义尚不确定时，应结合临床意见进行全面评估。本研究认为性别特异性参考区间仍有必要，理由有二：其一，在急诊手术背景下，钾水平评估直接指导手术决策，女性较低的上限参考限有助于更敏感地识别高钾血症风险；其二，现代实验室信息系统可自动匹配性别相应参考区间，临床实施不存在技术障碍。该性别差异可能归因于性激素对钾稳态的调节作用以及性别间肌肉量差异所致的总体钾含量差异。值得注意的是，该差异并非仅限于锂肝素血浆：血清钾也呈现方向与幅度相似的性别差异，提示该现象反映的是内在生物学差异而非抗凝剂所致基质效应。同时有必要区分统计学显著性与分区标准。尽管血清钾的性别差异有统计学意义（p = 0.002），但未达到WS/T 402-2024规定的分区阈值（Z = 2.55 vs. Z* = 3.33），而血浆钾的性别间差异满足分区标准（Z = 3.94）。血清钾是否需要性别特异性分区超出本研究范围。关于与制造商及文献区间的比较，本队列血浆钾的中心趋势与制造商说明书所述血浆参考区间（3.4–4.5 mmol/L；中点3.95 mmol/L）高度一致，男性与女性中位值分别为3.96 mmol/L与3.83 mmol/L。然而本研究得出的性别特异性区间明显更宽：男性3.21–4.72 mmol/L（跨度1.51 mmol/L），女性3.21–4.51 mmol/L（跨度1.30 mmol/L），而制造商区间跨度仅1.10 mmol/L且未按性别分层。若干因素可解释该差异。第一，制造商区间源自2001年历史数据，对来源人群与检测前程序的描述有限，且未进行性别分层。第二，本队列中男性钾值离散度大于女性（SD 0.33 vs. 0.28 mmol/L），单一合并区间无法兼顾两种分布，故男性所观察到的更宽参考限更符合性别特异性生物学变异而非随机误差。第三，每性148名受试者，参考限本身带有不可忽视的不确定性。Bootstrap估计参考限的90%置信区间，男性下限为3.08–3.56 mmol/L、上限为4.55–4.94 mmol/L，女性下限为3.10–3.37 mmol/L、上限为4.31–4.66 mmol/L。制造商下限3.4 mmol/L落在男性下限置信区间内，其上限4.5 mmol/L落在女性上限置信区间内；仅男性上限与女性下限在此不确定性范围之外与制造商值不同。从临床角度看，比制造商区间更相关的比较对象是该实验室既往使用的血清参考区间（3.5–5.5 mmol/L）。该区间更宽（跨度2.00 mmol/L），且比本研究建立的血浆区间高0.4–0.5 mmol/L。这一系统性偏移正是应用血清区间时血浆钾结果被重新分类的原因。相对于既往血清区间，本研究建立的血浆特异性区间更窄，判别性能更好。Jia等采用间接离子选择电极法在4524名中国汉族成人中建立血清钾参考区间3.6–5.2 mmol/L，未进行性别分层。应用该研究报告的血清–血浆平均差值0.23 mmol/L，可换算得等效血浆区间约3.37–4.97 mmol/L。该推算区间上限与本研究建立的性别特异性血浆区间吻合良好，而下限偏高。这提示即使来自中国人群的大样本血清参考区间也不能直接外推至锂肝素血浆样本。关于急诊背景下的回顾性分析及其临床意义，为进一步评估新建参考区间的临床适用性，本研究回顾性分析了该院38天内急诊生化检测的36555份锂肝素血浆钾结果。结果显示，应用原血清钾参考区间（3.5–5.5 mmol/L）时，16.97%的急诊血浆钾结果被重新分类。该发现提示，应用血清钾参考区间评价急诊血浆钾可能导致约六分之一急诊患者被误诊。在急诊手术背景下，假性低钾血症诊断可能触发不必要的静脉补钾，不仅增加医源性高钾血症风险，还可能导致非紧急手术延期，从而影响患者及时治疗。多项研究已证实术前低钾血症与术后心律失常风险增加、住院时间延长及其他并发症显著相关。因此，建立专门的血浆钾参考区间对保障急诊与围手术期患者安全具有重要实践意义。本分析存在固有局限。急诊科数据集为回顾性，缺乏可作为金标准的独立钾基线；临床诊断、用药及结局无法完整获取。因此重新分类率仅反映结果判读改变的程度，不应等同于诊断错误率。此外，分析单位为单次检测结果而非患者，同一患者重复测量可能影响分布；该混杂也可能与不一致区内观察到的性别差异有关。研究人员报告该观察结果而不推断因果关系。进一步评估新区间临床性能需要独立的健康个体队列，最好采用多中心设计，或开展前瞻性研究，将按新区间分类的结果与独立参考标准及临床结局进行分析。最后，参考区间确定的间接法值得探索作为大型急诊数据集的补充方法，尽管本队列以急重症患者为主违反了其核心假设即数据集应富含假定健康个体；基于抽样不确定性的验证策略可能有助于未来比较直接法与间接法建立的区间。关于本研究局限性，本研究存在若干局限。第一，所有受试者均来自中国人民解放军总医院健康体检人群，样本的地域代表性有待进一步扩展，未来需更大样本研究验证。此外，尽管建立参考区间所用的非参数法符合WS/T 402-2024要求，但不同分析系统在电极特性、基质效应及校准品溯源性方面存在差异。因此，在应用本研究结果前，各实验室应在本实验室分析系统及本地健康人群中验证参考区间，而非直接采用本文报告值。综上，锂肝素血浆钾与血清钾之间存在具有临床意义的系统性差异，二者不应共用同一参考区间。建立血浆钾参考区间时应充分评估性别相关生物学变异，如有指征则实施分层。结论部分译为：总之，血浆与血清钾之间存在具有临床意义的差异，现行血清钾参考区间不能用于准确评价患者实际血浆钾水平。本研究建立的符合中国卫生行业标准的性别特异性血浆钾参考区间（男：3.21–4.72 mmol/L；女：3.21–4.51 mmol/L）可为急诊及临床生化检测结果判读提供更准确、更科学的依据，具有重要临床应用价值。