微生物蛋白质参与了Fab二聚体化糖链反应性抗体的形成，这些抗体能够靶向糖基化的HIV-1包膜

《iScience》：Microbial proteins shape the development of Fab-dimerized glycan-reactive antibodies that target glycosylated HIV-1 envelope

**研究亮点：**
• Fab二聚化的糖链反应性（FDG）抗体（Abs）能够结合微生物蛋白；
• PGA4真菌蛋白可被FDG抗体结合，并能激活FDG Ramos B细胞；
• FDG抗体亚系在结合PGA4时表现出亲和力成熟；
• 细菌蛋白XcpQ也能结合FDG抗体，但亲和力较弱。

**摘要：**
Fab二聚化的糖链反应性（FDG）抗体（Abs）能够以糖链依赖的方式结合多种糖基化病原体。我们鉴定出从人类HIV-1感染（2G12）、HIV-1血清阴性个体（DH1005）、猴HIV（SHIV）感染（DH851.3）以及HIV-1疫苗接种（DH717.2）恒河猴体内获得的、能与FDG抗体结合的微生物蛋白。FDG单克隆抗体（mAbs）可结合白色念珠菌提取物中的多种蛋白，包括1,3-β-葡聚糖转移酶PGA4（PGA4）。重组PGA4同样以糖链依赖的方式被FDG抗体结合，四聚体PGA4在表达DH1005 IgM BCR的Ramos B细胞系中诱导钙流，这表明了B细胞的激活。此外，我们还发现人类粪便来源的肠道微生物群全细胞提取物中有多种细菌蛋白能与FDG抗体结合，其中包括铜绿假单胞菌XcpQ蛋白。重组XcpQ同样以糖链依赖的方式被FDG抗体结合。这些数据为了解这类独特糖链反应性抗体的产生机制提供了新的见解。

**引言：**
先前的研究表明，肠道微生物群抗原可能能够启动B细胞，使其在HIV-1疫苗接种或猴HIV（SHIV）感染时被招募参与免疫反应。最近，我们发现了一类独特的Fab二聚化糖链反应性抗体（FDG Abs），它们能够结合酵母抗原、人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）包膜（Env）糖蛋白及严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV-2）刺突蛋白表面的高甘露糖糖链。重要的是，部分来自SHIV感染猴子的FDG抗体具有中和多种HIV-1毒株的能力。然而，我们在HIV-1血清阴性个体中也发现了前体形式的FDG中和抗体，这提示宿主和环境中的糖基化抗原可能在激活B细胞、进而产生FDG抗体过程中发挥重要作用。因此，我们假设共生肠道酵母和细菌中的糖基化抗原可以激活或启动具有FDG反应性的B细胞，这些B细胞会在后续影响糖基化病原体或疫苗免疫原的感染中被招募，从而影响宿主的免疫反应发展。

**HIV-1 Env的特性：**
HIV-1 Env表面含有丰富的糖链，形成了一个有效的屏障，阻碍针对中和或其他效应功能所需靶位的抗体作用。自发现针对HIV-1 Env上特定高甘露糖区域的高效糖链反应性抗体2G12以来，人们一直致力于开发能够利用这些糖链的疫苗。到目前为止，2G12是唯一已知通过结构域交换形成Fab二聚体的糖链反应性单克隆抗体。然而，我们最近发现了通过重链（VH-VH）相互作用直接二聚化的FDG抗体，并证明这些二聚化抗体具有HIV-1包膜结合和中和功能。研究发现，这些抗体还能结合环境中的真菌（如白色念珠菌和新型隐球菌）及SARS-CoV-2刺突蛋白上的高甘露糖糖链。此外，高甘露糖含量的HIV-1 Env糖肽疫苗可促使现有的白色念珠菌反应性B细胞亚系向HIV-1 Env方向成熟。尽管这些真菌蛋白的具体作用机制尚未明确，但它们在调节B细胞反应中可能起到关键作用。

**肠道微生物组：**
肠道微生物组富含细菌来源的微生物蛋白，是塑造B细胞免疫的重要抗原来源。我们先前发现，从人类粪便样本中培养的肠道微生物群全细胞提取物（IM-WCL）中的细菌蛋白可与针对HIV-1 Env gp41区域的抗体发生交叉反应，从而在HIV-1疫苗接种后诱导强烈的免疫反应。利用免疫沉淀（IP）和质谱技术，鉴定出丙酮酸黄素氧化还原酶作为候选蛋白，其结构和序列与HIV-1 Env gp41高度相似，提示肠道微生物组在调节B细胞反应、促进其在类似抗原刺激下的免疫反应中起重要作用。类似地，这些数据表明IP结合质谱分析是有效识别参与微生物提取物与抗体交叉反应的候选蛋白的方法。

**真菌的作用：**
像白色念珠菌这样的真菌在哺乳动物和环境中共存广泛，构成微生物组中的重要组成部分。先前研究表明细菌蛋白能影响B细胞对HIV-1 Env gp41的反应，因此可以推测白色念珠菌提取物中的真菌抗原可能启动具有FDG反应性的B细胞；由于高甘露糖糖链在真菌抗原上大量存在，这类抗体也以它们为目标。目前关于酵母与HIV-1抗原之间交叉反应的研究较少，且尚未分离出能参与针对糖基化HIV、流感病毒、MERS-CoV、SARS-CoV-2及酵母抗原免疫反应的抗体。在本研究中，我们采用基于IP结合质谱的方法鉴定并表征了能与FDG抗体结合的真菌和细菌蛋白，进一步扩展了先前的研究。特别是，通过IP-质谱分析获得的重组蛋白验证了这些微生物蛋白与从HIV-1感染、猴SHIV感染及HIV疫苗接种个体中分离出的FDG抗体的结合能力。研究发现，主要候选真菌蛋白PGA4具有激活B细胞的能力，表明微生物蛋白在后续病原体或疫苗免疫反应中起重要作用。

**结果：**
为鉴定能与FDG抗体结合的真菌蛋白，我们采用IP结合质谱技术分析白色念珠菌提取物和IM-WCL中的糖基化真菌蛋白（见图1）。通过蛋白质组学分析，确认了被FDG抗体结合的候选蛋白，并将其重组后用于与FDG抗体的结合检测。该流程包括免疫沉淀、质谱分析等步骤，最终成功分离并表征了这些蛋白质。

**数据分析：**
- 对白色念珠菌提取物和IM-WCL中的FDG抗体结合蛋白进行了多步骤分析，首先使用FDG抗体进行免疫沉淀，然后通过质谱检测沉淀物中的蛋白质；
- 通过质谱分析确认的候选蛋白被重组后用于进一步验证其结合能力；
- 图1展示了整个分析流程；
- 数据显示，白色念珠菌提取物中的微生物蛋白在重组表达后可用于结合检测；
- 分析数据显示，SDS-PAGE和Western blot分析证实了这些蛋白的丰度；
- CH65抗体在白色念珠菌提取物中的结合能力较低，提示其与FDG抗体的亲和力较弱。

**结论：**
Fab二聚化的糖链反应性抗体（FDG Abs）能结合多种糖基化病原体，包括真菌和细菌蛋白。这些抗体在疫苗接种或感染过程中发挥重要作用，可能通过激活B细胞来增强宿主对病原体和疫苗的免疫反应。本研究不仅揭示了微生物蛋白在免疫反应中的关键作用，还为利用糖基化免疫原进行疫苗接种提供了新思路。未发现仅与CH65结合的蛋白质，这表明CH65与研究中的真菌蛋白质可能存在非特异性结合或低水平的交叉反应性，这与通过CH65检测到的蛋白质数量较少且丰度较低的现象一致（图2E）。
**类别：蛋白质（N）PNGS（%）**
**真菌蛋白质分析**
- CANAX蛋白质组：7358
- 88.7%
- 从IP中鉴定的蛋白质：745
- 2.6%
- DH1005+/2G12+/CH65-：470
- 85.5%
- 仅2G12+：310
- 0.0%
- 仅DH1005+：228
- 2.2%
- 仅CH65+：00
- DH1005或2G12+/CH65+：250
- 75.6%
**细菌蛋白质分析**
- 人类和细菌蛋白质组：7168
- 465.8%
- 从IP中鉴定的蛋白质：628
- 9.4%
- DH1005+：617
- 9.0%
- CH65+：569
- 68.9%
- DH1005-CH65+：597
- 4.6%
- DH1005-CH65+：119
- 0.9%

**表1：通过FDG反应性单克隆抗体结合的蛋白质参考数据库分析**
显示了CANAX、人类和细菌蛋白质组中编码≥1个PNGS的蛋白质百分比。CANAX蛋白质组包含7358种蛋白质，人类/细菌蛋白质组包含7168种蛋白质（20420种人类蛋白质和51264种细菌蛋白质）。
**缩写/符号说明**：数量（N）、百分比（%）、阳性/反应性（+）、阴性或非反应性（?）。

**新标签页中打开表格**

**验证FDG反应性单克隆抗体与通过IP鉴定的真菌蛋白质的结合**
我们选择了三种预测能与2G12结合的候选蛋白质中的一种（图2F）：1,3-β-葡聚糖基转移酶PGA4，这是一种锚定在糖脂磷肌醇（GPI）上的蛋白质，作为白色念珠菌细胞壁生物合成的葡聚糖基转移酶。PGA4还被认为在白色念珠菌等真菌病原体的毒力中起关键作用，因此支持进一步评估其通过FDG反应性单克隆抗体结合的相关性。此外，在仅通过与2G12结合的三种蛋白质中，PGA4在免疫沉淀物中检测到的肽量最高（n = 1,829，峰值面积）。首先，我们测试了五种FDG反应性单克隆抗体：来自人类HIV-1感染的FDG反应性bnAb、2G12、猕猴SHIV感染的DH851.3；以及来自HIV-1血清阴性个体的FDG反应性bnAb前体DH1005、猕猴SHIV感染的DH898.1和猕猴HIV-1疫苗接种的DH717.2。这些单克隆抗体代表了具有不同成熟程度的FDG反应性抗体，能够识别HIV-1 Env上不同糖型的高甘露糖结构，而前体则不能。我们测试了这些单克隆抗体与重组PGA4的结合情况，发现所有五种FDG反应性单克隆抗体都能与PGA4结合，而非FDG反应性的CH65单克隆抗体则不能（图3A）。在存在1 M D-甘露糖（代表高甘露糖结构）的竞争性ELISA中，FDG反应性单克隆抗体对PGA4的结合降低了≥50%（4/5种FDG反应性单克隆抗体，即2G12、DH851.3、DH717.2和DH898.1）（图3B），表明这种结合依赖于糖链。然而，DH1005在有无D-甘露糖的情况下对PGA4的结合水平相似，表明DH1005优先结合抗原表面的高密度或聚集糖链，这与某些FDG反应性单克隆抗体的结合特征一致。此外，通过表面等离子共振（SPR）测定，DH1005对PGA4的亲和力增加了超过一个数量级（KD = 1 nM），而其他具有可测量亲和力的FDG反应性单克隆抗体（包括DH717.2（KD = 41.5 nM）和DH898.1（KD = 37.9 nM）的亲和力较低（图3C–3E）。令我们惊讶的是，在SPR实验中（图3D），当用单克隆抗体流式过载固定的PGA4时，2G12没有显示出明显的结合，而在ELISA中则有结合（图3A和3B），这可能反映了基于低密度抗原的SPR实验的局限性，与基于高密度抗原的ELISA不同。通过生物层干扰测量法检测固定在PGA4溶液中的2G12时，反应性极低（未显示），这表明2G12与PGA4的结合亲和力较低，可能是由于其结构域交换所致，而其他FDG反应性单克隆抗体则表现为VH-VH二聚化。

**图3：FDG反应性单克隆抗体与重组PGA4蛋白的结合概况和亲和力测定**
**查看完整图例**
**（A）** FDG反应性单克隆抗体（2G12、DH1005、DH851.3、DH898.1、DH717.2）和非FDG反应性单克隆抗体（CH65）与重组PGA4蛋白的ELISA结合概况。结合强度以450 nm光密度（OD450nm）测量。误差条表示两次ELISA测量的平均值及其标准误差（SEM）。
**（B）** 在1 M D-甘露糖存在下的竞争性ELISA。结合强度以曲线下面积（AUC）表示，其中+表示存在D-甘露糖，-表示不存在D-甘露糖。误差条表示两次ELISA测量的平均值及其标准误差（SEM）。
**（C）** DH1005和CH65单克隆抗体在25 μm/mL浓度下与固定化PGA4配体的SPR测定。结合强度以响应单位表示，数据显示来自两次重复实验的结果。
**（D）** 四种结合力较弱（上样速率较低）的其他FDG反应性单克隆抗体和CH65阴性对照在50 μm/mL浓度下与固定化PGA4配体的SPR测定。结合强度以响应单位表示，数据显示来自两次重复实验的结果。
**（E）** 表格显示了三种FDG反应性单克隆抗体与固定化PGA4结合的结合常数（ka，M-1 s-1）和解离常数（kd，s-1）以及表观亲和力（Kd，nM）。数据代表两次重复实验的结果。

**PGA4激活表达FDG反应性DH1005 BCR的Ramos B细胞系**
据先前报道，响应HIV-1 Env抗原随时间成熟的人类FDG反应性B细胞前体的估计频率为每约340,000个B细胞中有1个，这比针对HIV-1 Env肽骨架上保守区域的非FDG反应性bnAb前体的频率高出几个数量级。因此，我们假设宿主或环境中的糖基化抗原可能会激活前体FDG反应性B细胞，使其在免疫反应中招募时具有优势。为了验证这一假设，我们测试了 PGA4（一种在重组蛋白表达过程中可能通过PNGS糖基化的真菌蛋白）是否能够激活携带DH1005 BCR的B细胞。DH1005是从HIV-1血清阴性个体中分离出来的，表明它可能是FDG反应性bnAb的前体。我们测量了这些Ramos B细胞中的钙离子（Ca2+）流速，以评估抗原驱动的激活作用，发现PGA4四聚体能够诱导DH1005 IgM携带的B细胞中的Ca2+流速（图4A和4B）。这些数据表明微生物抗原可以激活B细胞，并可能诱导后续的B细胞克隆扩增，这是B细胞成熟过程的标志。此外，另一项未发表的研究表明HIV-1包膜蛋白也能诱导DH1005 IgM Ramos B细胞系中的Ca2+流速（通讯作者S. Munir Alam），从而提供了非微生物糖基化蛋白也能激活FDG反应性B细胞的证据。

**图4：DH1005 FDG反应性抗体与B细胞激活的亲和力**
**查看完整图例**
**（A）** 在暴露于四聚化PGA4（蓝色）或抗人IgM F(ab’)2（灰色）的Ramos B细胞中，随时间变化的钙离子流速。
**（B）** PGA4的数据根据与抗人IgM F(ab’)2交联的Ramos B细胞中的最大信号进行了归一化。数据显示了四次测量的结果。
**（C）** DH851（C）和DH717（D）谱系中UCA和成熟FDG反应性抗体的ELISA结合概况。结合强度以450 nm光密度（OD450nm）测量。误差条表示两次ELISA测量的平均值及其标准误差（SEM）。

**我们无法确定DH1000的未突变共同祖先（UCA）或近胚系抗体的置信度，因为它在其谱系中是唯一鉴定出的抗体。** 相比之下，我们之前已经确定了DH717和DH851 FDG谱系的UCA基因，这些谱系每个克隆中有多个抗体。我们发现PGA4与携带推断出的UCA基因的DH717和DH851抗体结合较弱，而成熟抗体（图4C和4D）的结合更强。这些具有更多体细胞突变的重链和轻链基因的成熟抗体对PGA4的结合更强，表明FDG B细胞谱系对真菌蛋白（如PGA4）的亲和力发生了成熟。

**识别和表征与FDG反应性单克隆抗体交叉反应的细菌蛋白**
为了证明我们方法在不同微生物蛋白上的可重复性（图1），我们使用了具有最高亲和力的FDG反应性单克隆抗体DH1005，它在IM-WCLs中筛选出可能与PGA4真菌蛋白结合的候选微生物蛋白（图S1A–S1D），这些IM-WCLs主要包含肠道微生物组的细菌蛋白。我们使用了一个包含71,684种人类和细菌蛋白的参考数据库，因为IM-WCL来源于人类粪便样本。我们在IM-WCL中发现了628种与DH1005和/或CH65结合的候选蛋白（图S1C，数据S3），其中69.4%的蛋白质编码了PNGS（表1）。我们还发现，与DH1005结合的617种人类/细菌蛋白中有69.0%编码了PNGS，与CH65结合的569种人类/细菌蛋白中有68.9%编码了PNGS，仅与DH1005结合的59种人类/细菌蛋白中有74.6%编码了PNGS（表1）。此外，仅与CH65结合的11种人类/细菌蛋白中有90.9%也编码了PNGS（表1），这表明FDG反应性单克隆抗体并未在研究的71,684种蛋白质数据库中富集编码PNGS的人类/细菌蛋白。

**使用仅与DH1005结合而与CH65不结合的59种蛋白质的基因名称在STRING中进行的通路分析** 发现与铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）相关的蛋白富集，这提示需要进一步评估该菌株的候选蛋白（图S1E）。数据集中最丰富的铜绿假单胞菌蛋白是XcpQ（图S1F和S1G；数据S4），这是一种参与通过II型分泌途径跨外膜转运蛋白的外膜蛋白。值得注意的是，FDG反应性单克隆抗体与重组XcpQ蛋白结合（图S2A），并且这种结合依赖糖链（通过D-甘露糖竞争ELISA验证，图S2B）。在1 M D-甘露糖存在下，DH1005对XcpQ的结合减少了36.5%（图S2B），这表明这种细菌蛋白的糖基化程度低于真菌PGA4，或者这些病原体上的糖链呈现方式可能存在差异，从而影响FDG反应性单克隆抗体的相互作用。这些数据还表明FDG反应性单克隆抗体在不同微生物蛋白之间的交叉反应性，可能会影响它们的功能性和生物过程。

**FDG反应性单克隆抗体的多反应性**
我们之前报道，FDG反应性单克隆抗体在与一小部分自身抗原和HEp-2细胞表面结合时多反应性有限。然而，鉴于DH1005抗体对PGA4的相对高亲和力（1 nM，图3C和3E），我们想了解它们在更大范围的自身抗原中是否表现出更强的多反应性。在此，我们测试了代表FDG反应性单克隆抗体的几种代表抗体对HuProt库中21,197种人类蛋白的多反应性，发现2G12的多反应性为2.6%（n = 549），DH1005的多反应性为0.5%（n = 102）（图5A；数据S5）。非FDG反应性的CH65单克隆抗体仅与0.05%（11/21,197）的测试人类蛋白发生交叉反应（图5A；数据S5）。当仅考虑同时与2G12和DH1005结合但不与CH65结合的蛋白时，我们发现了47/21,197（0.2%）的蛋白，这表明FDG反应性单克隆抗体具有介导多反应性的共同结构模块。实际上，44/47（94%）的人类蛋白被预测编码PNGS（数据S6），因此这些单克隆抗体可能针对糖基化蛋白具有特异性交叉反应性。然而，我们不能排除某些编码PNGS的蛋白可能由于糖型或糖链排列的差异而不与FDG反应性单克隆抗体结合。DH1005和2G12与测试的21,197种人类自身抗原中的0.5%和2.6%蛋白的有限交叉反应性也可能反映了这些自身抗原中糖基化蛋白的低频率。此外，这些人类蛋白之间的糖类型或取向差异也可能影响FDG反应性单克隆抗体的多反应性结果。

**使用HuProt微阵列分析FDG反应性抗体与哺乳动物宿主蛋白的多反应性**
**查看完整图例**
**（A）** 汇总了微阵列中包含的蛋白总数。接下来列出了每种单克隆抗体与FDG抗体（DH1005和2G12）反应但与流感抗体CH65无反应的蛋白数量（Z-score ≥3）。最后，主要候选蛋白是三聚体构象的糖基化表面蛋白，并且具有实验确定的结构。Z分数的范围和中位数已经列出。对于最后两个类别，2G12和DH1005微阵列运行的Z分数被汇总用于描述性统计（范围和中位数）。(B) 列出了主要候选蛋白。在HuProt微阵列中测试的三种单克隆抗体的Z分数也包括在内，其中#N/A表示Z分数低于3.0的纳入标准。基因名称来源于HuProt报告文件，而从相关UniProt数据库中选取了最高分辨率的蛋白质数据银行（PDB）结构，并包括了PDB代码及其分辨率（?）。(C) 使用cealign命令和PGA4（AlphaFill结构Q5AJY5）进行的PyMOL结构比对结果，包括原子位置的均方根偏差（RMSD）（以?为单位）和对齐的残基数。(D) 排序图显示了2G12（n = 549/21,197，2.59%）、DH1005（n = 102/21,197，0.481%）或CH65（n = 11/21,197，0.052%）结合的人类蛋白质的Z分数作为阳性指标。另见数据S5和S6；图S3。为了进一步研究结合FDG反应性mAbs的人类蛋白质，我们选择了同时结合2G12和DH1005但未结合CH65的47种蛋白质中符合以下四个标准的蛋白质：(1) 编码能够促进糖基化的PNGS；(2) 在细胞表面表达；(3) 采取三聚体构象；(4) 具有已发表的结构。我们确定了四种符合我们标准的具有不同生物功能的蛋白质（图5B）：酸敏感离子通道1（ASIC1）、CD70抗原（CD70）、P2X嘌呤受体4（P2RX4）和压电型机械敏感离子通道组分1（PIEZO1）。尽管所有候选蛋白质至少包含一个PNGS，但通过这些蛋白质的结构建模确定的序列相似性有限，无法支持与PGA4的结构重叠；这四种主要候选蛋白与PGA4的结构比对显示均方根偏差（RMSD）在6.2至10 ?之间（而相同分子结构的RMSD大约为零）。因此，这些数据表明PGA4与ASIC1、CD70、PRRX4或PIEZO1人类自身抗原之间没有显著的结构重叠。此外，仅对ASIC1、CD70、PRRX4和PIEZO1人类蛋白质进行的类似结构建模分析也显示这些蛋白质之间没有结构重叠（图S3）。这些数据表明，mAbs的FDG反应性主要是由PNGS促进的糖基化驱动的，即使在序列或结构上没有显著的同源性。然而，需要确定FDG反应性mAbs与这些蛋白质之间的序列或结构同源性程度才能实现交叉反应。然而，与非FDG反应性mAb CH65相比，FDG反应性mAbs 2G12和DH1005与该数组中的更多人类蛋白质具有交叉反应性（图5D）。

讨论
FDG反应性mAbs已被证明能够结合真菌生物体C. albicans和C. neoformans的裂解物，在此我们确定了C. albicans中的PGA4作为介导这些mAbs与真菌结合的特定真菌蛋白。总体而言，FDG反应性mAbs表现出对PGA4的糖基依赖性结合，而四聚体PGA4能够激活表达DH1005 FDG反应性BCR的Ramos B细胞。这些发现支持了微生物糖蛋白可能有助于激活和促进FDG反应性B细胞反应的假设。此外，我们还确定了IM-WCL中的细菌XcpQ蛋白，它也能以糖基依赖性方式结合FDG反应性mAbs，尽管其结合强度低于PGA4。这些发现建立了一个分析流程，用于识别被FDG反应性Abs识别的微生物蛋白，并为未来的研究提供了候选微生物抗原的资源。总体而言，这些结果扩展了我们对可能影响针对糖基化病原体和疫苗免疫原的免疫反应的宿主-微生物相互作用的理解。
FDG反应性mAbs在人类蛋白质上的多反应性有限，DH1005的多反应性是2G12的1/5，因此鉴于人类中出现耐药真菌，DH1005被认为是一种潜在的抗真菌治疗策略候选mAb。PGA4在真菌细胞壁的生物合成中起着关键作用，并且在C. albicans感染早期上调，但删除PGA4基因已被证明可以增强C. albicans菌株对现有抗真菌药物的耐受性，这表明它对当前抗真菌药物是必需的。目前尚不清楚FDG反应性mAb与PGA4的结合如何影响C. albicans菌株对现有抗真菌药物的敏感性。此外，FDG反应性mAb通过与其他能够结合FDG反应性mAb的微生物蛋白的相互作用对酵母和其他微生物的致病性的影响尚未完全了解。因此，需要进一步探索FDG反应性mAb的治疗潜力。
PGA4以纳摩尔亲和力（KD = 1 nM）结合DH1005 mAb，并激活表达DH1005 IgM的Ramos B细胞，表明微生物糖蛋白可以参与并激活FDG反应性BCR。这种刺激程度是否足以驱动随后的B细胞成熟事件，包括生发中心参与、类别转换重组、体细胞突变以及分化为长寿的记忆细胞或浆细胞，目前尚不清楚。B细胞激活已在从微摩尔（μM）到低纳摩尔（nM）范围内的结合亲和力下被报道，即使是相对较弱的结合抗原（KD = 100 μM）也能激活初始B细胞。因此，PGA4与DH1005 mAb之间的高亲和力（KD = 1 nM）相互作用与有效的BCR结合和信号传导是一致的。亲和力也被认为与B细胞激活有关，这促使人们使用多聚形式抗原进行体外B细胞激活实验。与此原则一致，四聚体PGA4能够诱导表达DH1005 IgM的Ramos细胞中的Ca2+流动，而单体PGA4则不能（未显示）。此外，关联率已被证明会影响HIV-1 Env三聚体蛋白对B细胞激活的作用，在此我们显示DH1005 mAb与单体PGA4结合时的关联速率很快（Ka = 1.01 × 107 M?1s?1）。我们的数据提出了PGA4可以通过生发中心或滤泡外成熟途径激活B细胞从而启动成熟过程的假设，这使得这些细胞在最初对糖基化病原体和免疫原的反应中具有相对较高的招募频率。FDG反应性mAb对细菌蛋白XcpQ的结合显著较弱，因此无法进行可靠的亲和力测量，因此我们的B细胞激活研究仅限于FDG反应性mAb在纳摩尔水平上结合的PGA4蛋白。
FDG反应性mAb表现出对真菌、细菌和宿主蛋白的交叉反应性，尽管它们在序列或结构上的同源性有限。看来，具有关联糖基化能力的PNGS的存在可能是这种交叉反应性的关键驱动因素。现在已经确定，真核生物和细菌具有自己的机制来促进类似的N连接的蛋白质糖基化过程。重组真菌PGA4和细菌XcpQ在基于酵母的细胞系统中表达，其中已经报道了糖基化机制，但真菌和细菌蛋白也可以在其自身生物体内自然糖基化。我们的数据支持在FDG反应性mAb通过IP捕获的C. albicans裂解物和IM-WCLs中存在糖基化的真菌和细菌蛋白。然而，FDG反应性mAb与微生物蛋白的结合强度和交叉反应性的广度可能受到PNGS数量、PNGS上是否存在糖基以及PNGS上糖基构象的影响；其中一些因素可能解释了FDG反应性mAb与真菌PGA4相比与细菌XcpQ的结合强度更高（数据S2和S4）。
了解糖谱，包括糖基的数量和糖基在宿主和环境抗原（包括宿主蛋白和病原体如HIV-1 Env、流感HA、MERS-CoV、SARS-CoV-2以及酵母）上的呈现方式，可能为通过免疫原设计来引发针对这些表位的FDG反应性mAb提供见解。在这里，我们确定了一种真菌蛋白和一种细菌蛋白能够结合FDG反应性mAb，并为评估我们数据集中的其他候选微生物抗原提供了框架。真菌和细菌裂解物含有大量的蛋白质；因此，我们的发现很可能大大低估了能够结合FDG反应性mAb的微生物蛋白的数量。未来的研究定义微生物蛋白质上的糖基结构和呈现模式将进一步阐明FDG反应性抗体识别的机制。了解FDG反应性中和抗体的发展将扩大我们对这类尚未充分研究的B细胞的了解，这些B细胞可能通过适当的策略用于对抗糖基化病原体，而我们目前还没有临床批准的疫苗或治疗方法。虽然诱导针对不同多系HIV-1菌株的强效且广谱的HIV-1 Env反应性bnAbs是HIV-1疫苗的金标准，但许多bnAb表位被HIV-1 Env上的密集糖基屏蔽所掩盖。因此，了解能够利用Env糖基屏蔽的FDG反应性mAb的发育可能为未来针对HIV和其他糖基化病原体的治疗策略的设计提供见解。

研究的局限性
在这里，我们在数百种候选蛋白中确定了一种真菌和一种细菌蛋白，可以使用我们概述的方法进一步验证它们与FDG Abs的反应性。我们展示了PGA4和XcpQ的序列中含有PNGS以容纳糖基，并通过使用重组D-甘露糖进行的竞争性抑制实验评估了糖基相互作用，该D-甘露糖模拟了自由的高甘露糖糖基，但我们没有实验确定这些蛋白上存在的糖基类型。此外，我们研究了在酵母系统中表达的糖蛋白，这可能影响这些蛋白与酵母或细菌裂解物中的糖基化模式。

资源可用性
如需进一步的信息和资源，请联系主要联系人Wilton B. Williams ([e-mail])。

材料可用性
本研究中生成的所有独特/稳定试剂均可从主要联系人处获得，需完成材料转移协议。

数据和代码可用性
• 与本研究相关的所有数据均已在论文或补充材料中提供。用于质谱分析的蛋白质数据库的原始数据和fasta文件以及分析结果已上传至MassIVE仓库（数据库：MSV000102221），可通过ftp://massive.ucsd.edu/v13/MSV000102221访问。
• 本研究未生成新的代码。
• 如需重新分析本文报告的数据，可向主要联系人索取额外信息。

致谢
我们感谢Kevin O. Saunders提供2G12抗体，以及Barton F. Haynes提供的肠道微生物群衍生的全细胞裂解物（IM-WCL），这些在研究中得到使用。我们感谢Marlene Violette和Matt Foster（Duke Proteomics and Metabolomics Core Facility）进行的样品处理和蛋白质组学分析，感谢ProMab Biotechnologies Inc.（www.promab.com）进行的重组微生物蛋白的表达和纯化，以及CDI Labs的Scott Paschke和Shaohui Hu进行的HuProt v4.0人类蛋白质组微阵列实验。我们还要感谢Robert Parks、Maggie Barr和Tess Overton在提供关键试剂方面的支持。该项目由NIAID R01AI165147（PA和WBW）和U54AI170752（PA）资助，Duke医学院Whitehead Fellowship（WBW）以及NIH R38基金（R38CA245204）（RM）支持。我们感谢Duke HIV/AIDS研究中心、Duke PRIME Prep项目（BC）和医师科学家发展办公室在技术支持方面的资助（RM）。

作者贡献
W.B.W.设计了这项研究，分析了所有数据，并撰写了论文。R.R.M.建立了分离结合FDG反应性mAb的微生物蛋白的流程，并编辑了论文。B.C.进行了IP和Western blot实验，并编辑了论文。R.H.T.进行了ELISA和结构建模分析，并编辑了论文。M.M.建立了Western blot实验。K.C.、A.P.K.和S.M.A.进行了亲和力测量实验，并开发和测试了表达FDG反应性BCR的Ramos B细胞系。P.A.提供了关键资源。利益声明：作者没有竞争利益。

**STAR**
**方法**
**关键资源表**

| REAGENT或RESOURCES | SOURCE | IDENTIFIER |
|-----------------|------|-------------------------|------------------------|
| 抗体 | DH1005 | Williams等人 | |
| | 2G12 | Williams等人 | |
| | CH65 | Williams等人 | |
| | ADH89 | 8.1 | Williams等人 |
| | ADH71 | 17.2 | Williams等人 |
| | ADH85 | 1.3 | Williams等人 |
| 抗人IgG（全分子） | | 用山羊产生的磷酸酶抗体 | Sigma-Aldrich | Cat#A1543-1 ML; RRID: AB_257935 |
| 过氧化物酶亲和纯化山羊抗人IgG，Fcγ片段特异性 | | Jackson ImmunoResearch | Cat#109–035–098; RRID: AB_2337586 |
| 鼠抗猴IgG-HRP | | SouthernBiotech | Cat#4700-05; RRID: AB_2796069 |

**化学品、肽和重组蛋白**
| PGA4重组蛋白 | | ProMab Biotechnologies, Inc. | |
| | XcpQ重组蛋白 | | ProMab Biotechnologies, Inc. |
| 序列级改良胰蛋白酶 | | Promega | Cat#V5111 |
| Evotip Pure | | Evosep Biosystems | Cat#EV2011 |
| PepSep? Classics 15 cm × 150 μm × 1.5 μm柱 | | Bruker Corporation | Cat#1893474 |
| 结合素 | | ThermoFisher Scientific | Cat#434301 |

**关键的商业检测**
| 交联免疫沉淀试剂盒 | | Thermo Fisher Scientific | Cat#26147 |
| BCA蛋白测定试剂盒 | | Thermo Fisher Scientific | Cat#23225 |
| ExpiFectamine 293转染试剂 | | Life Technologies, Gibco | Cat#A14524 |
| FLIPR?钙6测定试剂盒 | | Molecular Devices | Cat#R6133 |
| HuProt人类蛋白质组微阵列v4.0 | | CDI Laboratories | https://www.cdilabs.com/services/huprot-microarray |

**生物素化试剂盒**
| 生物素偶联试剂盒（快速，Type A）– Lightning-Link? | | Abcam | Cat#ab201795 |
| Micro Bio-Spin? P-30 Tris色谱柱 | | Bio-Rad | Cat#732–6223 |

**存档数据**
| 白色念珠菌蛋白质组数据库UP000536275 | | UniProth | https://www.uniprot.org/proteomes/UP000536275 |
| 人类蛋白质组数据库UP000005640 | | UniProth | https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 |
| 12细菌蛋白质组数据库IPX0003851001 | | iProX; Zhao等人 | https://www.iprox.cn/page/subproject.html?id=IPX0003851001 |
| 本文描述的免疫沉淀物的蛋白质组数据（MassIVE仓库MSV000102221） | | ftp://massive.ucsd.edu/v13/MSV000102221 |

**实验模型：细胞系**
| Expi 293i | | Thermo Fisher Scientific | Cat#A14635 |
| DH1005 Ramos细胞 | | 本文 |

**实验模型：生物体/菌株**
| 白色念珠菌裂解物 | | Leinco Technologies, Inc（前身为QED Bioscience）| Cat#BA117VS |
| 人类粪便中的肠道微生物群全细胞裂解物 | | Williams等人 | |

**软件和算法**
| STRING联盟 | | https://string-db.org |
| Spectronaut 19.5 | | Biognosys | https://biognosys.com/software/spectronaut/ |
| FragPipe | | Nesvilab | https://github.com/Nesvilab/FragPipe |
| Prism v10 | | GraphPad | http://graphpad.com |
| BiacoreTM T200评估软件 | | Cytiva Life Sciences | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/support/software/biacore-downloads/biacore-t200-software |
| SoftmaxPro 7.1 | | Molecular Devices | –PyMOL分子图形系统v3.1.8 | Schr?dinger, Inc. | https://www.pymol.org/ |
| GenePix软件 | | CDI Laboratories | |

**其他**
| NuPage 4–12%梯度Bis-Tris凝胶 | | Thermo Fisher Scientific | Cat#NP0321 |
| iBLOT 3转移堆栈 | | Thermo Fisher Scientific | Catalog#IB34003 |
| Precision plus蛋白阶梯 | | Bio-Rad | Cat#1610375 |
| X LDS样品缓冲液 | | Thermo Fisher Scientific | Cat#NP0007 |
| 凝乳蛋白块 | | Thermo Fisher Scientific | Cat#PI3753 |
| 20X MOPS运行缓冲液 | | Thermo Fisher Scientific | Cat#NP0001 |
| Western blue稳定磷酸酶底物 | | Promega | Cat#S3841 |
| SureBlue Reserve? TMB单组分微孔过氧化物酶底物 | | SeraCare Life Sciences | Cat#5120–0083 |
| D-(+)-甘露糖 | | Sigma-Aldrich | Cat#M6020 |
| Biacore T200 | | Cytiva Life Sciences | –HBS-EP+缓冲液10×（使用1x浓度）| Cytiva Life Sciences | Cat#BR1008 |

**方法细节**
**使用FDG反应性mAb和白色念珠菌裂解物进行免疫沉淀**
白色念珠菌裂解物是从商业来源（QED Bioscience，圣地亚哥，CA）获得的，浓度为0.52 mg/mL，我们使用Thermo Fisher的30 K MCWO蛋白浓缩器将其浓缩至1.72 mg/mL，使用Thermo Fisher Scientific的BCA蛋白测定试剂盒（目录号23225）进行浓缩。然后使用Thermo Fisher Scientific的交联免疫沉淀试剂盒（目录号26147）进行交联免疫沉淀反应。为了偶联抗体，将50 μg的抗体与超纯水和20x偶联缓冲液混合至100 μL的总体积中，以维持最终1x的缓冲液条件。将抗体混合物直接加入柱中的树脂中。将柱子盖好并在室温下旋转盘上孵育60分钟，以保持树脂的悬浮状态。对于每500 μg的裂解物，向旋转柱中加入40 μL的对照琼脂糖树脂浆。柱子在室温下孵育60分钟，并轻轻上下混合。孵育后，将柱子以1000 × g离心1分钟。收集上清液，用于与固定的抗体孵育。为了制备交联剂，向一个DSS试管中加入217 μL的DMSO，制成25 mM的储备溶液。将混合物上下震动直至完全溶解。将此储备溶液以1:10的比例稀释于DMSO中，制备2.5 mM的工作溶液。向柱子中加入总共50 μL的交联溶液。柱子在室温下旋转盘上孵育60分钟。为了评估交联情况，加入50 μL的洗脱缓冲液并离心；收集上清液。使用nanodrop 2000检测上清液中的抗体浓度，确保洗脱样本中没有检测到抗体，这表明只有来自裂解物的蛋白质被洗脱。将白色念珠菌细胞提取物稀释在IP裂解/洗涤缓冲液中，生成预清蛋白裂解物。向每个柱子中加入总共500 μg的预清蛋白裂解物，体积为300–600 μL。将柱子盖好，并在4°C下温和混合过夜。孵育后，将柱子离心，收集上清液。用200 μL的IP裂解/洗涤缓冲液洗涤柱子一次，然后再用200 μL的缓冲液洗涤两次，每次洗涤后都进行离心。最后一次洗涤使用100 μL的1x调理缓冲液。每个样本都用于十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）/Western印迹和质谱分析。将柱子放入新的收集管中，向柱子中加入10 μL的洗脱缓冲液，然后离心，再加入50 μL的洗脱缓冲液。将柱子在室温下孵育5分钟，不进行混合或密封，之后离心，收集上清液。通过Western印迹分析洗脱液中的抗原存在情况。根据需要，进行额外的洗脱，每个洗脱液分别进行分析。为了保存偶联抗体的树脂，立即对柱子进行再生和储存。

**IM-WCL的获取**
IM-WCL之前是从人类粪便样本中获得的，如上所述。冷冻的裂解物小瓶在冰上解冻，然后进行IP和Western印迹分析，以及对IP测定中由FDG反应性mAb捕获的蛋白质进行质谱分析。

**通过SDS-PAGE和Western印迹评估mAb与微生物蛋白质的相互作用**
**SDS-PAGE**
从IP实验中获得的交联免疫沉淀样本用Thermo Fisher Scientific的4X LDS样品缓冲液（目录号NP0007）稀释，得到最终1x的样品缓冲液浓度，然后将每个1x稀释的样品24 μL加载到Thermo Fisher Scientific的NuPage 4–12%梯度Bis-Tris凝胶（目录号NP0321BOX）的泳道中。凝胶电泳在150 V的恒定电压下进行1.5小时，使用通过稀释20X MOPS运行缓冲液（Thermo Fisher Scientific，目录号NP0001）和去离子蒸馏水获得的1x MOPs运行缓冲液。我们使用Bio-Rad Laboratories的precision plus蛋白阶梯（目录号1610375）作为Bis-Tris凝胶中的分子量参考。

**Western印迹**
在SDS-PAGE之后，将凝胶中的蛋白质样品转移到Thermo Fisher Scientific的硝酸纤维素膜（iBlot 3转移堆栈，目录号IB34003）上，然后用凝乳蛋白块（Thermo Fisher Scientific，目录号PI37532）封闭膜1小时。使用FDG反应性mAb 2G12或DH1005以及阴性对照mAb CH65对膜进行蛋白质检测。将mAb在凝乳蛋白块中制备至最终浓度30 μg/mL，并在4°C下孵育膜过夜。mAb与膜孵育过夜后，用含有1% Tween 20的PBS洗涤膜3次，每次洗涤5分钟。然后将产生活性蛋白的山羊抗人IgG磷酸酶抗体稀释至最终浓度1:2000，在凝乳蛋白块中孵育1小时，随后用Promega的Western blue稳定磷酸酶底物（目录号S3841）在室温下孵育1分钟。使用Bio-Rad Chemidoc成像系统记录膜上的蛋白质图像。

**白色念珠菌和IM-WCL中与FDG反应性mAb结合的蛋白质的蛋白质组分析**
将洗脱物调整至5% SDS，然后加入10 mM二硫苏糖醇并在80°C下加热10分钟。冷却后，加入25 mM碘乙酰胺，然后在黑暗中孵育30分钟。最后，使用S-trap微装置（Protifi）按照制造商的协议处理样品，并在47°C下用0.5 μg的序列级改良胰蛋白酶（Promega）消化1小时。洗脱物进行冻干，并在含有0.1%（v/v）甲酸的水中复溶，最多一半的肽被加载到Evotip Pure一次性捕获柱（Evosep）上，使用制造商的协议。

**LC-MS/MS分析**
使用Evosep One LC与Thermo Orbitrap Astral连接，通过Nanospray Flex离子源进行。Evosep采用每天30个样本的方法，使用Pepsep 15 cm × 150 μm柱（1.5 μm颗粒大小）和PepSep Sprayer以及不锈钢（30 μm）发射器。MS分析使用240,000分辨率的Orbitrap前体离子（MS1）扫描，范围380–980 m/z，AGC目标为500%，最大注射时间（IT）为50 ms，每0.6 s收集一次数据。MS/MS使用DIA方法，默认电荷状态=3，前体质量范围为380–980，4 m/z分离窗口，AGC目标为500%，最大IT为6 ms，所有MS2扫描都使用标准化碰撞能量（NCE）为28%。原始MS数据使用HTRMS转换器转换为*.htrms格式，并在Spectronaut 19.5中处理。使用Candida albicans Uniprot数据库（UP000536275，下载于2025年1月28日，附有污染物序列，使用FragPipe（共7,476条记录）或Homo sapiens Uniprot数据库（UP000005640，下载于2024年9月13日，附有污染物序列，使用FragPipe（20,468条记录）和包含51,264条记录的12细菌数据库进行直接DIA搜索。搜索设置包括trypsin/P特异性，最多2次未切割；肽长度为7–52个氨基酸，固定氨基甲酰甲基（Cys）、可变甲硫氨酸氧化、赖氨酸甲基化和N端蛋白质乙酰化。数据过滤时设置为1%前体和蛋白质组假发现率（q值），并使用MaxLFQ算法进行蛋白质丰度汇总。

**从我们的IP数据集中排除了非白色念珠菌蛋白质，因此分析了745种真菌蛋白质（数据S1）；由于IM-WCL来源于人类粪便样本，因此排除了非人类和非细菌蛋白质，分析了628种蛋白质（数据S3）。白色念珠菌裂解物来源的蛋白质使用CANAX蛋白质组（7358种蛋白质）进行分析，IM-WCL来源的蛋白质使用包含71,684种蛋白质的参考人类和细菌蛋白质组数据集进行分析。**

**通过ProMab表达重组微生物蛋白质**
目标蛋白基因（PGA4、XcpQ）被克隆到ProMab的酵母表达质粒中，并包含His标签。使用X-33 Pichia pastoris细胞进行电穿孔，然后将线性化的表达质粒接种到琼脂板上。选择菌落，在不同条件下诱导表达蛋白质，并通过SDS-PAGE验证蛋白质表达。简而言之，吸收了蛋白基因的细胞培养至对数生长阶段（OD600 = 2–6）。然后收获细胞并将其重新悬浮在YP培养基中以进行诱导。每隔24小时添加100%甲醇，最终浓度为0.5%，共添加96小时。一旦确认了初始表达条件，就使用电穿孔的原始细胞制备更大的酵母细胞培养物。收集上清液并使用Ni-NTA树脂珠进行纯化。蛋白质从珠子中洗脱，然后透析至1x PBS。通过SDS-PAGE和Western印迹验证蛋白质的纯度和大小，并通过BCA测定验证浓度。最终蛋白质进行冻干。

**在我们的检测中使用重组微生物蛋白质**
首先将冻干的蛋白质和复溶缓冲液（不含核酸酶的无菌水）恢复至室温，然后轻轻摇晃小瓶，确保所有冻干的蛋白质位于小瓶底部。然后分取足够的缓冲液，使冻干蛋白质的浓度达到0.5–1 mg/mL，每次不要添加过多的缓冲液。通过轻轻上下吸取来复溶蛋白质，避免剧烈吸取、振荡或涡旋。然后将复溶的蛋白质分装至>20 μL的体积中，并在?20°C下长期储存或在4°C下立即使用。

**ELISA中重组微生物蛋白质与FDG反应性mAb的结合**
在384孔板上，以2 μg/mL的浓度覆盖30 ng的蛋白质，并在0.1M碳酸氢钠中过夜。然后用含有0.05% Tween 20的PBS洗涤板孔，再用含有3% BSA的PBS封闭板孔1小时，然后再洗涤一次。然后在ELISA中测试的抗体稀释至100 μg/mL，溶解在含有1% BSA和0.05% Tween 20的PBS中。将100 μg/mL的抗体混合物在96孔板中以1:3的比例连续稀释11次；10 μL的稀释抗体在蛋白质包被的板上孵育1小时。 Plates被洗了两次，随后每个孔中加入10微升1:8000的HRP结合的二次抗体（人类抗体 – Jackson Immunoresearch，目录号109–035–098；猕猴抗体 – Southern Biotech，目录号4700-05），并在室温下孵育1小时。之后，孔被洗了四次，然后加入20微升室温下的TMB底物（KPL SureBlue Reserve，目录号5120-0083）。与TMB底物孵育15分钟后，加入20微升1%的HCl终止溶液，并在450纳米处读取光密度。使用GraphPad Prism软件制作图表。所有洗涤步骤都是在BioTek 405 LS板洗涤机上进行的，该设备会分配100微升洗涤缓冲液，然后再吸走。

### 竞争性ELISA
使用商业购买的D-甘露糖（Sigma，圣路易斯，密苏里州；目录号M6020）来竞争mAb与微生物蛋白PGA4和XcpQ上的糖链的结合。按照之前的描述，使用1M D-甘露糖进行竞争性ELISA。简而言之，ELISA使用含有1% BSA和0.05% Tween 20的PBS作为mAb的稀释液，在有或没有1M D-甘露糖的情况下进行。ELISA步骤按照上述方法进行，但稀释液用于制备1M D-甘露糖溶液，以便在有D-甘露糖的情况下测试mAb的结合。除了测试FDG反应性的mAb外，还使用了抗流感CH65非FDG反应性mAb作为阴性对照。

### PGA4蛋白上FDG反应性mAb的亲和力测量
使用SPR测定法测试DH1005、DH898.1、DH717.2、DH851.3和2G12 mAb与PGA4的结合，在BIAcore T200仪器（Cytiva）上，使用HBS-EP+ 1x运行缓冲液在25°C下进行。然后使用单循环动力学测量DH1005、DH898.1和DH717.2的亲和力。简而言之，PGA4以300 RU的捕获水平固定在CM5芯片上。然后以逐渐增加的浓度（分别为0.5 - 8 nM、20–320 nM和40nM–640nM）注射mAb。滴定周期包括五次180秒的mAb注射，并在最后一次注射后有720秒的解离时间。芯片表面用10 mM Glycine pH 2.0再生。使用HBS-EP+运行缓冲液进行滴定周期，以消除信号漂移，并使用空白流式细胞进行双参考减法。结果曲线拟合通过BIAcore T200评估软件（Cytiva）完成。拟合使用了异质配体模型或1:1 Langmuir模型。滴定曲线代表了两个数据集。

### PGA4的生物素化与四聚体化
按照Abcam的Fast, Typa A生物素化试剂盒（目录号ab201795）的制造商说明，将重组PGA4与生物素结合。简而言之，PGA4与修饰剂反应物混合后，加入冻干的生物素结合混合物中，轻轻重悬并在室温下避光孵育15分钟。然后加入淬灭剂并再孵育5分钟。这种结合混合物使用Micro Bio-Spin P-30 Tris色谱柱（Bio-Rad，目录号732–6223）进行纯化，柱子的缓冲液更换了三次PBS。生物素化的抗原流通过Streptavidin（ThermoFisher Scientific）以1:4的比例每15分钟增加一次浓度进行四聚体化。在每个15分钟的增量过程中，抗原在23°C下使用Thermomixer C（Eppendorf）以900 rpm的速度搅拌。

### DH1005 IgM Ramos细胞系中的Ca2+通量测量
如前所述，Ramos细胞系来源于同一个IgM阴性的亲本系，然后通过稳定转染表达感兴趣的VH/VL IgM BCR。在这里，我们研究了表达DH1005 BCR的Ramos细胞。Ca2+通量实验使用FlexStation 3微孔读取器（Molecular Devices）和SoftmaxPro 7.1（Molecular Devices）以及FLIPR Calcium 6染料（Molecular Devices）进行，如前所述。抗原在50微升的RPMI培养基（Gibco）+ FLIPR Calcium 6染料（Molecular Devices）混合液中稀释至200 nM的浓度并接种。最终的抗原浓度为100 nM，因为实验中还加入了额外的50微升细胞。空白孔仅含有RPMI/染料混合物的荧光用于背景减法。减去背景荧光后，将抗原荧光值归一化到IgM对照的最大信号，然后将Ca2+通量值以百分比表示。Ca2+通量数据代表了4次测量的平均值。

### HuProt阵列上的抗体靶标鉴定
为了鉴定抗体的靶标，我们使用了一个包含超过21,000种独特、单独纯化的全长人类蛋白质的人类蛋白质微阵列（HuProt Human Proteome Microarray v4.0，CDI Laboratories，Mayaguez，PR），这些蛋白质有双重拷贝，覆盖了超过81%的蛋白质组。简而言之，HuProt阵列在室温下用阻断溶液（5% BSA/1xTBS-T）封闭1小时，然后用抗体样品（10 μg/mL）在室温下探针1小时。随后用1×TBS-T洗涤三次，每次10分钟，再用Alexa 647标记的抗人IgG-Fc二次抗体（1:2,000稀释；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）在室温下探针1小时，接着用1×TBS-T洗涤三次，每次10分钟，然后用空气干燥器干燥，并使用GenePix 4000B仪器（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）扫描。使用GenePix Pro软件测量抗体与阵列特征的结合信号强度。每个蛋白质重复点的原始中值荧光强度（MFI）被平均并转换为对数2形式，然后进行Z分数分析。阳性 hit 在该样本数组的对数2转换原始MFI数据中Z分数大于3.0的范围内被识别。

### 重组mAb的表达
使用商业购买的质粒（GeneScript，Piscataway，NJ）产生大量重组mAb，这些质粒含有抗体重链和轻链基因，通过ExpiFectamine 293转染试剂（Life Technologies，Gibco；目录号A14524）转染到Expi 293i细胞中，随后按照描述的方法纯化和储存。所有重组mAb都来源于编码人类或猕猴IgG恒定区域的质粒，并通过Western blot检测重链和轻链蛋白的适当表达，或者通过尺寸排阻色谱（SEC）验证是否为单峰，表明抗体表达稳定。

### 序列和结构同源性分析
我们使用PyMOL分子图形系统（版本3.1.8）进行蛋白质的结构建模以评估同源性。PGA4的结构作为.a.cif文件从AlphaFill（Q5AJY5）下载，因为其结构不在PDB上可用。对于其他所有蛋白质，使用列出的PDB标识符在PyMOL环境中获取实验确定的结构（图5B）。然后使用cealign命令（语法：cealign PDB_ID_1, PDB_ID_2）对齐蛋白质结构。我们保存了 alignment 图像，并从PyMOL命令行窗口中记录了RMSD和残基数。为了确定微生物蛋白质序列中的PNGS，首先从UniProt（www.uniprot.org）获取这些蛋白质的氨基酸序列。其次，使用Excel函数查询这些序列中38种N-连接糖基化序列N-X-S/T（X≠P）的迭代；X可以是N和S/T配对中的19/20种氨基酸，共有38种可能的组合。

### 使用STRING进行基因通路分析
仅与FDG反应性mAb 2G12和/或DH1005相互作用的微生物蛋白质的基因名称通过STRING（www.string-db.org）进行分析，该数据库编译、评分并整合了来自实验测定、计算预测和先验知识的蛋白质-蛋白质关联信息。通过质谱鉴定出的蛋白质名称直接复制并粘贴到STRING数据库中，并选择相应的真菌或细菌蛋白质的生物体。STRING分析的结果包括KEGG通路推断、分子生物学功能、描述基因网络的出版物富集等，如本文所示。

### 定量和统计分析
我们进行了描述性统计，包括HuProt库微阵列中每种mAb结合的蛋白质的Z分数的范围和中位数。描述性统计在Microsoft Excel中进行，数据显示在图5A中。

### 补充信息（7）
- 下载所有内容：PDF（1.26 MB）文档S1。图表S1–S3
- 电子表格（86.81 KB）：数据S1。IP与FDG反应性和CH65 mAb针对C. albicans裂解物的质谱结果，与图1相关。
- PDF（76.98 KB）：数据S2。PGA4的氨基酸和预测核苷酸序列，与图1和图2相关。
- 电子表格（69.38 KB）：数据S3。IP与FDG反应性和CH65 mAb针对IM-WCL的质谱结果，与图1和S1相关。
- PDF（83.61 KB）：数据S4。XcpQ的核苷酸和预测氨基酸序列，与图S2和STAR方法相关。
- 电子表格（64.80 KB）：数据S5。HuProt库中与mAb结合的蛋白质列表，与图5相关。
- 电子表格（16.94 KB）：数据S6。与DH1005和2G12 FDG反应性mAb交叉反应的人类自身抗体的分析，与图5和S3相关。