高分辨离子迁移-串联质谱（IM-MS/MS）结合循环离子迁移（cIMS）与稳定同位素标记解析质子化芬太尼及m/z 188异构碎片的碎片化机制

《Analytica Chimica Acta》：Disentangling the Fragmentation Mechanisms of Protonated Fentanyl by Ion Mobility-Resolved Tandem Mass Spectrometry (IM-MS/MS)

　　

质子化芬太尼呈现两个离子迁移特征，代表质子化位点异构体（protomers；质子化分别位于哌啶氮和酰胺氧）。离子迁移-串联质谱（IM-MS/MS）显示，这两个迁移特征具有独特的碎片化谱。多程循环离子迁移（cIMS）测量显示，共同碎片m/z 188具有三个独特特征。通过无损离子操控结构（SLIM）离子迁移与MS/MS分析芬太尼同位素异形体（isotopologues），确认来源于两个初始质子化位点异构体的三条独特碎片化通路。

芬太尼是强效合成阿片类药物，常用于手术和严重疼痛管理；非法制造芬太尼与近二十年致命过量增加相关。可疑样品虽可用芬太尼试纸（FTS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱等便携/手持技术筛查，但液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）仍是临床与法医毒理学中测定芬太尼及其代谢物的高灵敏、高选择性方法之一，常采用m/z [337 → 188]转变进行单反应/多反应监测（SRM/MRM）。然而，质子化芬太尼及其主要碰撞诱导解离（CID）产物的气相结构及碎片化机制长期存在争议。Callery and coworkers曾提出m/z 188主要来自N-苯基丙酰胺中性丢失，生成1-(2-苯乙基)-1,2,3,6-四氢吡啶；但合成该化合物后其MS/MS谱与质子化芬太尼的[337 → 188 →] MS3谱不匹配，因而提出两条竞争通路生成两种异构m/z 188碎片。Jackson and coworkers结合MSn与高分辨质谱（HRMS）提示m/z 188至少存在三种同量异位碎片，并警告广泛使用[337 → 188]可能影响定量分析的准确度和精密度。Butler and Baker用漂移管离子迁移-质谱（DTIM-MS）观察到质子化芬太尼两个迁移峰，提示多构象或多质子化位点；研究人员所在团队随后在十余种芬太尼类似物中观察到类似到达时间分布，并用迁移对齐MS/MS发现不同迁移峰具有独特碎片谱，提出哌啶氮和酰胺位点质子化的质子化位点异构体。Ieritano et al.结合高分辨离子迁移（HRIM）、紫外光解离（UVPD）、光谱和计算建模进一步支持哌啶氮与酰胺羰基氧质子化归属。尽管已有大量工作，m/z 188同量异位物种的结构身份及碎片化通路仍不明确；由于[337 → 188]在定量分析中极常用，理解其碎片化通路十分必要。本研究因此联合高分辨离子迁移、迁移对齐串联质谱、多程cIMS、同位素标记和计算建模，进一步阐明芬太尼碎片化机制。该研究的意义在于为芬太尼类似物、新精神活性物质（NPS）及IM-MS中鉴定质子化位点异构体提供分析框架，并提示气相实验参数选择对IM和MS分析的重要性。

关键技术方法（不超过250字）：研究采用SLIM高分辨离子迁移-质谱（MOBIE HRIM SLIM与Agilent 6546 QTOF）和循环离子迁移谱（cIMS；SELECT SERIES Cyclic IMS），结合源内、cIMS前捕获池和cIMS后转移池碰撞活化、迁移对齐MS/MS、伪MS3、多程cIMS切片回注、能量分辨串联质谱（ERMS）、氢-氘交换（HDX）、对氟芬太尼（pFF）、¹³C₆标记芬太尼和4-苯氨基-N-苯乙基哌啶（4-ANPP）分析，并进行微动弹性带（NEB）过渡态计算。芬太尼类似物标准品购自Cayman Chemical（Ann Arbor, MI）的DEA豁免制剂。

研究结果：
1. 高分辨离子迁移谱（HRIMS）方法评估（Assessment of High-Resolution Ion Mobility Spectrometry (HRIMS) Methods）：SLIM和cIMS均显示与既往多种IM技术一致的迁移分布。IM-MS/MS显示，较高迁移、较高丰度的337IM1主要产生m/z 188.14、105.07及少量146.10；较低迁移、较低丰度的337IM2产生m/z 216.14、188.14、134.10、132.08和105.07。m/z 105被普遍认为是苯乙基阳离子（C₈H₉⁺），而m/z 188身份仍有疑问，既有研究提示至少两种同量异位碎片。该部分结论是两个迁移特征具有不同碎片谱，需用高分辨IM和串联质谱定位通路。
2. cIMS-MS/MS与伪MS3（cIMS-MS/MS and Pseudo-MS3）：5程cIMS可基线分离两个迁移特征，其后转移池活化得到的MS/MS谱与SLIM及既往DTIM-MS/MS相似。源内活化（锥电压120 V）后四极杆隔离m/z 188并进行9程cIMS，得到188IM1（124 ms）、188IM2（130 ms）和188IM3（133 ms）三个迁移特征；均提取于m/z 188.1439，与C₁₃H₁₈N⁺一致，未观察到明显m/z 188.1048（C₁₂H₁₄NO⁺）信号。对每个188IM特征进行伪MS3后，三者均以m/z 188和105为主要峰但相对丰度不同，且分别产生独特中间碎片：188IM1生成m/z 134，188IM2生成m/z 146，188IM3生成m/z 132。基于这些独特模式，研究提出三条异构m/z 188碎片通路：337IM1（哌啶氮质子化）先中性丢失丙酰基生成m/z 281，再丢失N-苯基生成188IM2，后者进一步生成m/z 146并最终生成105；337IM2经两条平行通路，分别经异构m/z 281（丙酰基丢失并伴随质子转移至仲胺）和经m/z 216中间体（丢失N-苯乙基）生成188IM1与188IM3，再分别生成134/105与132。ERMS结果支持这些顺序碎片化通路。原文指出不包含[188IM3 → 132 → 105]通路，因188IM3结构（季铵上电荷定域）不可行，图2D中少量m/z 105来自188IM2与188IM3迁移峰不完全分辨的重叠。
3. 芬太尼类似物与氢-氘交换（HDX）的MS/MS研究（MS/MS Investigation of Fentanyl Analogs and Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX)）：对氟芬太尼（pFF）经5程cIMS显示两个主要迁移峰；355IM1碎片（m/z 188、146、105）与芬太尼一致，符合氟苯基丙酰胺中性丢失，并检测到少量m/z 299（对应加氟的m/z 281中间体），未检测到m/z 281；355IM2出现m/z 234、206、150等新碎片，对应337IM2碎片通路的氟化等价物。¹³C₆标记芬太尼经13米SLIM分析，前体为m/z 343；343IM1碎片通路与未标记芬太尼相同，但检测到少量m/z 287（对应m/z 281中间体），证实337IM1经337 → 281 → 188IM2 → 146/105；343IM2出现m/z 222、194、138等独特碎片，对应337IM2经188IM3的¹³C₆等价物，同时仍见m/z 188（188IM1）、134和105，提示337IM2 → 188IM1先经苯基丙酰胺中性丢失并丢失同位素标记；该标记实验仅凭188与194同时存在即确认另外两种异构m/z 188碎片。4-ANPP显示两个主要迁移峰（推测为哌啶-N和仲胺-N质子化），其MS/MS谱与337IM1及337IM2 → 188IM1匹配；较小迁移峰似乎仅经质子转移至哌啶环，未检出m/z 216或132，提示丙酰胺对生成m/z 216和188IM3关键。HDX中氘化芬太尼[M+D]⁺ m/z 338为唯一前体；338IM1产生m/z 282、188/189、146、105，证实先前m/z 281保留前体质子而带质子（现为氘化），m/z 188与189近等丰度可由Callery and coworkers提出的两种m/z 188物种经氢负离子重排互变解释，146和105质量不变则确认其非质子化结构；338IM2产生m/z 282、217、188/189、135、133，证实337IM2 → 281和337IM2 → 216碎片带质子，135和133质量位移也提示这些碎片带质子。
4. cIMS/IMS互变研究与能量计算（cIMS/IMS – Interconversion Studies and Energy Calculations）：串联cIMS/cIMS中，质子化芬太尼经5程后切片回注再5程，337IM1主要保持原到达时间，仅极少量次级峰，提示337IM1 → 337IM2互变很弱；337IM2切片回注后呈更明显双峰，约20%互变回337IM1，这与其活化时酰胺氧向仲胺质子转移、生成哌啶环电荷定域的188IM1相符。m/z 188碎片经捕获池碎裂后分布与源内碎片相似，仅188IM2与188IM3相对丰度轻微反转；188IM3切片回注呈单峰分布，几乎不与188IM1或188IM2互变；188IM1与188IM2存在互变。互变关系可概括为337IM2 > 337IM1、188IM2 > 188IM1 > 188IM3；而稳定性（以前体离子丰度判断）为337IM1 > 337IM2、188IM3 > 188IM1 > 188IM2，稳定性与互变可能性呈相反趋势。既往文献将337IM1归为哌啶氮质子化（CCS约182–183 ?²），337IM2归为酰胺氧质子化（CCS约188–189 ?²）；O-质子化位点异构体能量上不利，与N-质子化位点异构体相差>80 kJ/mol，但匹配CCS的结构可通过微溶剂化和/或质子化位点异构体锁定解释。NEB计算显示O→N质子转移吉布斯自由能垒为25.5 kJ/mol，逆向为144.9 kJ/mol；反应性O-质子化位点异构体构象比最低自由能O构象高39.5 kJ/mol，质子转移过渡态比该最低点高65.0 kJ/mol，提示进入反应性构象可能限制O→N转化，而逆反应能垒高不利于经该通路再生成O-质子化位点异构体。

讨论总结：该研究将两个初始质子化位点异构体与三条m/z 188异构碎片通路对应起来，并通过cIMS切片回注、同位素标记、HDX和ERMS支持通路及气相互变；O→N与N→O质子转移能垒差异和构象可及性解释互变倾向。研究同时强调离子源条件和气相实验参数会影响质子化位点异构体相对丰度及碎片行为，对依赖[337 → 188]的定量分析具有警示意义。

研究结论部分翻译：芬太尼质子化位点异构体的观察，以及芬太尼碎片化通路模糊可能影响依赖m/z [337 → 188]转变的定量LC-MS/MS分析，构成了理解气相芬太尼基础行为的关键挑战。通过高分辨离子迁移、串联离子迁移、串联质谱和同位素标记系列实验，研究确证芬太尼经三条独特解离通路，各生成其独特的m/z 188中间体。原始质子化位点异构体的相对丰度已显示高度依赖离子源条件，m/z 188碎片也观察到一定（优先的）气相互变；这些观察进一步强调在IM和MS分析中选择气相实验参数的重要性。总体而言，该研究提供了一个分析框架，可用于表征其他芬太尼类似物、新精神活性物质（NPS），并更广泛地用于IM-MS鉴定到的任何质子化位点异构体。