《Analytical Biochemistry》：Isoprenoid quinone profiling using a novel semi-quantitative HPLC-MS/MS method: application to wastewater sludges
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异戊二烯醌是一类多样化的氧化还原活性脂质，在所有生命领域的核心生物过程中发挥关键作用。本研究旨在克服现有方法的局限，开发一种新型HPLC-MS/MS方法以监测多种异戊二烯醌。研究人员提出了一种HPLC-Orbitrap方法，将14分钟的色谱分离与平行反应监测（
异戊二烯醌是一类多样化的氧化还原活性脂质，在所有生命领域的核心生物过程中发挥关键作用。本研究旨在克服现有方法的局限，开发一种新型HPLC-MS/MS方法以监测多种异戊二烯醌。研究人员提出了一种HPLC-Orbitrap方法，将14分钟的色谱分离与平行反应监测（PRM）、高分辨质谱和鐶离子（tropylium ion）确认相结合，可对89种醌进行初步注释。对13种真实醌标准品（商业来源或从微生物培养物中纯化）实现了定量，对其他醌实现了半定量。将该方法应用于废水污泥时，检测到57种不同的醌，揭示了不同处理阶段间的显著多样性。该HPLC-Orbitrap方法通过实现对迄今最广泛的醌谱的定量和半定量分析，为微生物生态学和环境监测开辟了新的可能性。
**研究背景与问题**
异戊二烯醌（isoprenoid quinones）是一类由醌环与聚异戊二烯链共轭构成的氧化还原活性脂质，广泛参与所有生命领域的核心生物过程。其聚异戊二烯链的长度和饱和度在不同生物间差异显著，部分可达16个异戊二烯单元。最常见的醌类如泛醌（ubiquinone, UQ，即辅酶Q）和甲基萘醌（menaquinone, MK，即维生素K）因在人类健康与营养中的作用而广受关注。微生物醌谱分析已成为不依赖培养的微生物生态监测有力工具，尽管仅少数醌为特定分类群所特有，但醌分析可为微生物群落结构与功能提供见解，有助于优化废水处理等过程。
然而，现有方法存在明显局限。传统方法多采用液-液萃取或超临界流体萃取，结合毛细管电泳、气相色谱或高效液相色谱（HPLC）C18柱分离，检测手段包括紫外吸收、荧光、化学发光、电化学和质谱（MS）。这些方法均局限于对少数醌（如辅酶Q10或维生素K）的靶向分析，因色谱重叠及灵敏度与选择性限制，无法捕获复杂微生物样品中醌的完整多样性。早期Hiraishi等开创的HPLC-UV方法虽可在废水污泥和微生物席中定量多达26种醌，但需耗时的手动分级分离泛醌和甲基萘醌。近期HPLC-MS方法扩展了MK分析范围，在人粪便中检测到MK4:4至MK13:13，灵敏度达皮摩尔级，但忽视了UQ和部分饱和MK（如MK9:7），后者由许多放线菌门（Actinomycetota）物种产生。最先进的HPLC-MS/MS方法可在42分钟内解析37种醌，包括UQ7:7至UQ10:10、MK6:6至MK11:11及若干部分饱和MK，其优势在于基于碎片谱（特别是醌环特征的丰富鐶离子）鉴定醌。然而，由于醌标准品商业可得性有限，依赖单一标准品定量整个醌系列（MK4:4用于所有MK，UQ10:10用于所有UQ）是关键局限，因MK同系物（MK4:4至MK13:13）的MS响应可相差达十倍，可能引入定量不准确。
**研究开展与结论**
针对上述局限，研究人员开发了一种新型HPLC-MS/MS方法以监测广泛多样的醌。所提出的HPLC-Orbitrap方法结合14分钟色谱分离、平行反应监测（PRM）、高分辨质量和鐶离子确认，可对89种醌进行初步注释，对13种真实醌标准品实现定量，对其他醌实现半定量。应用于废水污泥时，检测到57种不同醌，揭示不同处理阶段的显著多样性。该方法通过实现迄今最广泛醌谱的定量与半定量分析，为微生物生态学和环境监测开辟新可能。
**关键技术方法**
研究人员主要采用以下关键技术方法（忽略试剂与具体培养、质粒构建步骤）：（1）构建包含17种醌的标准品混合物，包括商业可得醌、氘代类似物，以及从酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）纯化的UQ6:6和从谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）Ubi5-Pd细胞纯化的长链MK；（2）UHPLC-Orbitrap高分辨质谱方法，采用C18柱与甲醇/异丙醇梯度，分别建立非靶向Full MS/dd-MS2方法与靶向PRM方法；（3）样品队列来源为法国Romans-sur-Isère废水处理厂，2025年6月每周采样一次、连续3周，采集初沉、浓缩、活性及脱水四类污泥（部分设三平行或二平行）；（4）基于MZmine的非靶向MS/MS数据处理与基于TraceFinder的PRM数据处理，并辅以Python和R脚本进行过滤与统计分析（PCA、PERMANOVA、PERMDISP）。
**研究结果**
3.1 非靶向LC-MS/MS方法开发：研究人员组装17种醌标准品混合物，开发C18柱甲醇/异丙醇梯度HPLC方法，11分钟内实现有效分离。发现峰面积差异显著，MK1:1-d7几乎不可检测而被排除，PK响应远低于MK4:4，提示链饱和度影响离子化效率；加合物形成受链长影响，短链以质子化（H?）为主，长链以铵加合物（NH??）为主，MK11:11和MK11:10差异达40倍；碎片谱显示UQ和MK分别在m/z 197.0806和187.075处有显著鐶离子。通过信号线性评估计算LOD、LOQ和ULOQ，多数醌ULOQ为20或50 pmoles。基于多种生物样品非靶向分析构建醌谱库，共鉴定75个醌相关特征，质量偏差小于3 ppm。
3.2 靶向LC-MS/MS方法开发：研究人员开发基于PRM的靶向方法，以鐶离子为诊断碎片，纳入标准品（MSI一级）、非靶向鉴定特征（二级）及预测醌（三级）。严格过滤（保留时间0.15分钟、质量精度2 mmu）有效排除干扰，如区分MK10:9与MK10:10的13C?同位素。PRM方法显著改善LOD和LOQ（如UQ4:4从1.1 fmoles改善至350 fmoles以下），扩展ULOQ拓宽动态范围，所有标准品变异系数（CV）中位数低于10%。发现趋势线系数与链长呈线性相关，MK4:4–11:11和UQ6:6–10:10系列差异分别约3.04倍和2.95倍，据此以最近两个标准品均值估算无标准品醌的响应因子以实现半定量。
3.3 废水污泥醌提取与基质效应：研究人员对四类污泥每周采样连续3周，用氘代醌评估提取效率与基质效应。三种氘代标准品提取损失均极小，但MK4:4-d7基质效应显著，回收率低至14%，而MK9:9-d7和UQ10:10-d9回收率分别为93.7%和100%，提示短链醌受基质干扰更严重。
3.4 靶向方法在废水污泥中的应用：在51个样品中，89种靶向醌里检测到57种，涵盖UQ2:2–UQ12:12和MK4:4–MK15:15。最丰富的苯醌为UQ8:8和UQ10:10，主要萘醌为MK7:7、MK8:8和MK8:6。醌谱在三周采样期内保持一致，PCA区分脱水污泥，Hellinger变换后PCA按处理阶段分离样品，尤其初沉污泥。PERMANOVA显示污泥类型间醌谱差异显著（R2=0.723，p=0.001），污泥类型效应远大于周效应（R2=0.040）。初沉污泥周间变异性最大，可能反映进水组成波动。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该HPLC-MS/MS方法实现了迄今最广泛醌谱的灵敏分析（UQ2:2至MK15:15），仅需14分钟色谱分离（含柱再平衡20分钟），较现有最先进方法分析时间减半。研究发现短链醌主要形成H?加合物、长链醌更易生成NH??加合物，检测灵敏度亦依赖链长，短链MK和UQ的LOD约为长链的两倍；响应因子在标准品系列内变异约三倍，表明以单一标准品定量不令人满意。当前对无标准品醌的半定量依赖响应因子估算，虽引入不确定性，但可通过从可大规模培养微生物中纯化更多标准品（如DMK、PQ、mPQ）来克服。基质效应在短链醌中尤为显著，故未对污泥数据校正，该数据集应主要视为比较价值而非绝对值；可通过固相萃取等步骤缓解。方法目前多基于高分辨分子质量和碎片谱鉴定，无法区分异构体，MK8:6和MK9:5的双键位置值得进一步研究。检测到的mPQ7:7至mPQ10:10提示污泥中存在多种Nitrospira物种，其作为生物标志物的潜力值得结合宏基因组分析验证；UQ在污泥中占主导可能反映人源UQ10与假单胞菌门（Pseudomonadota）源UQ的综合。方法在废水处理、微生物生态及人类健康微生物组研究中具有前景。
结论部分译为：靶向UHPLC-Orbitrap方法在仅14分钟色谱分离内实现了迄今最全面的异戊二烯醌集合的分析。对12种有标准品的醌实现定量分析，对其他醌通过估算响应因子实现半定量分析。灵敏度依醌类型在55.2至0.3飞摩尔间。应用于污水污泥时，该方法检测到57种不同醌，并揭示废水处理各阶段不同的醌谱。该方法可用于复杂样品中醌的谱分析，在推进微生物生态学、环境监测和生物技术应用方面具有显著潜力。
