《Cell Reports Methods》：Gene library deep sequencing for protein superfamily profiling
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研究动机：遗传文库（genetic libraries）是系统注释蛋白质及基因调控功能的关键资源。然而，可靠的生物学洞见依赖于在单核苷酸分辨率上完整且准确定义的文库。尤其已知开放阅读框（open reading frame，ORF）文库中不期望的编码序列变异会
研究动机：遗传文库（genetic libraries）是系统注释蛋白质及基因调控功能的关键资源。然而，可靠的生物学洞见依赖于在单核苷酸分辨率上完整且准确定义的文库。尤其已知开放阅读框（open reading frame，ORF）文库中不期望的编码序列变异会严重限制可获信息的深度，这凸显了严格序列验证的必要性。尽管如此，遗传文库常仅经部分独立序列验证即被采用，部分原因在于可扩展、成本有效且高准确度的下一代测序（next-generation sequencing，NGS）方法仍有限。为此，研究人员通过开发一种整合文库制备、测序和变异识别（variant calling）的无条形码深度测序流程，以单核苷酸精度实现遗传文库验证。
研究亮点：以高精度表征遗传文库仍具挑战性；PPLseq（pooled plasmid library sequencing，混合质粒文库测序）使混合文库的无条形码、可扩展测序成为可能；基因和变异检测揭示既往未记录的文库变异；研究人员应用PPLseq构建用于表达谱分析的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor，GPCR）文库。
摘要：规模化解析蛋白质功能仍具挑战性。利用ORF文库的功能获得（gain-of-function，GOF）筛选可系统注释驱动细胞行为和药物作用的蛋白质。然而，基因覆盖不均和不期望的编码序列变异损害ORF文库完整性并限制可获生物学洞见。相比之下，用于表征当前和下一代ORF文库的测序方法仍有限。为此，研究人员开发了可扩展文库深度测序流程PPLseq（pooled plasmid library sequencing，混合质粒文库测序），用于成本有效、无条形码且具单核苷酸分辨率的ORF测序。在>300个人GPCR原型超家族文库中，PPLseq验证了ORF身份并揭示序列和覆盖度变异。将PPLseq整合至高通量基因工程促进了新GPCR融合文库的组装。系统性的基于成像的表型分析识别出稳健表达但研究不足的受体。总之，这些结果证明广泛适用、可及且准确的遗传文库测序可用于从文库到表型（library-to-phenotype）的谱分析，以更深入理解蛋白质组功能。
研究背景与问题：理解人类基因组所编码约20,000种蛋白质的形式与功能是重要科学任务，但功能定义通常依赖实验研究。与功能缺失实验互补，基于ORF文库的GOF筛选可剖析蛋白质（过）表达对复杂细胞行为的影响。然而，池化或阵列化ORF文库的生成与传代常导致基因覆盖不均、不期望的编码序列变异、重组事件和脱靶效应，这些因素单独或共同限制文库完整性及筛选效力；编码序列变异尤其限制可获生物学深度，因此需要严格序列验证。NGS已常规用于短蛋白结构域或基因调控序列池化筛选中的富集定量，但全长ORF文库很少经NGS验证；已有少数ORF物种文库测序验证研究或依赖较旧的454焦磷酸测序和有限变异识别方法，或方法和变异评估信息有限；超家族范围ORF文库常未经独立验证或仅部分验证。GPCR超家族由约300种多样性受体及约400种嗅觉受体构成，是重要药物靶点，但超家族范围GPCR文库很少，大规模功能研究仍具挑战，且测序需求需与高通量基因工程规模匹配。因此，研究人员系统开发蛋白质超家族文库深度测序方法，评估短读长测序的可扩展性，建立PPLseq并验证现有GPCR文库，进而构建新荧光GPCR文库用于表型谱分析。
研究开展与结论及意义：研究人员建立无条形码PPLseq，将序列唯一性分析、池化文库制备、NGS和变异识别整合，先以314个非嗅觉人GPCR的PRESTO-Tango文库为原型验证，证明其可在单核苷酸分辨率捕获文库内容并报告既往未记录的ORF变异；随后将PPLseq用于Golden Gate高通量基因工程，构建246个mCherry融合GPCR的新文库，并通过共聚焦显微成像和单细胞分析进行表达谱分析。研究结论表明，PPLseq可准确鉴定ORF、识别高置信变异、表征亚文库并支持新序列验证文库构建；新GPCR融合文库可用于超家族表达谱分析并识别稳健表达但研究不足的受体。其意义在于提供广泛适用、可及且准确的遗传文库测序框架，支持现有及新一代池化文库验证和从文库到表型的蛋白质功能研究。
关键技术方法：研究以滑动窗口（50、75、150、300 b）对314个非嗅觉人GPCR、495个激酶和1,993个转录因子（transcription factor，TF）ORF进行序列唯一性分析；样本来源包括PRESTO-Tango GPCR collection（Addgene Kit #1000000068）以及DNASU提供的人激酶和TF ORF序列。PPLseq对池化质粒文库直接进行paired-end 150 b NGS，采用BWA-MEM比对、SAMtools统计和FreeBayes进行池化及单倍型感知的变异识别，并以Sanger和Nanopore测序验证高置信变异。新文库通过Golden Gate（SapI/BsmBI）构建亚文库并经PPLseq验证，随后在HEK293细胞中表达，以共聚焦显微成像和单细胞图像分析量化表达。该段约230字。
研究结果：
可扩展的无条形码ORF文库测序：通过滑动窗口唯一性分析，GPCR文库在50、75、150和300 b窗口下均显示序列唯一；激酶和TF文库仅在150和300 b窗口出现少量非唯一片段，涉及MAP2K2与MST4异构体、STAT5A/STAT5B等旁系同源基因、共享外显子基因或内部串联重复基因。研究结论为，在无异构体或长重复的文库中，读长≥150 b时无条形码正确比对具有可行性；若同一ORF的技术重复克隆分布于不同亚文库，池化短读长测序可扩展至蛋白质超家族测序。
PPLseq工作流程：通过GPCR文库克隆复制生长、板扫混合、质粒DNA提取、无需ORF扩增或条形码的NGS建库与测序，并进行比对、覆盖度统计和变异识别，建立PPLseq流程。研究结论为，该流程可对池化ORF文库进行深度测序，并为后续ORF鉴定和变异解析提供统一分析框架。
ORF鉴定：通过将PPLseq读段比对至参考ORF，发现除6个ORF外均有读段比对，初始鉴定率>98%；308个充分比对ORF的中位读数为38,487条、中位覆盖深度为4,300×。GLP2R、GPR1、HTR1D和RXFP3无接种点且PCR未能从池中分离，LPAR5和SSTR1仅0—2条读段，Sanger测序显示LPAR5为替代DNA序列变体、SSTR1序列与SSTR2相同。研究结论为，PPLseq可在单次无条形码NGS反应中准确捕获ORF文库内容，未检出ORF可归因于源文库缺失或参考序列不一致。
变异解析：通过单核苷酸水平变异识别，除上述6个ORF及PTH1R外均获得全长覆盖；308个全长覆盖ORF中302个与参考序列100%一致，6个各报告1个单核苷酸变异（single-nucleotide variant，SNV），多为单核苷酸多态性。BB3、DRD3和PTH1R的三个高置信变异经Sanger和Nanopore测序确认，分别为同义变异、非同义变异及较参考序列长22个氨基酸的序列；C5A低替代碱基读段比例变异未获确认；人工引入的10个SNV均以高置信度检出；同聚物区两个低质量缺失未获确认。研究结论为，PPLseq具有可信的单核苷酸分辨率变异识别能力，并揭示既往未记录的文库变异。
新文库构建：通过Golden Gate方法，以SapI（229个ORF）和BsmBI（51个ORF）从池化文库扩增并插入mCherry载体，构建6个亚文库，并以PPLseq逐一表征。各亚文库插入率一般>80%，673个插入ORF中558个（82.9%）与参考序列一致，其余含1—3个变异且主要为SNP，可能为ORF克隆过程中引入；最终组装246个mCherry融合受体，除GABBR1、GPR150、RXFP1的同义替换及CHRM5一个非同义替换为最大化文库规模而纳入外，均具100%序列覆盖且无变异。研究结论为，PPLseq可支持规模化文库构建、插入反应特异性评估和序列验证。
GPCR表达谱：通过将246个GPCR-mCherry融合体在HEK293细胞中表达，并以共聚焦显微成像和单细胞分析量化表达，共分析12,300个视野中720万个单细胞，平均每个ORF约29,200个细胞；228个（92.7%）受体荧光水平超过阴性对照均值5个标准差以上，荧光水平跨一个数量级且生物学重复间稳健。Class C或B2 GPCR总体表达较低；在中高表达受体中，80个受体已知配体为0—2个，63个受体可用原子分辨率结构为0—2个。研究结论为，该新文库可用于GPCR超家族表达谱分析，并识别稳健表达但研究不足、可供后续生化与结构研究的受体。
讨论部分总结：GOF ORF筛选是原位大规模探索蛋白质功能的有力工具，NGS已用于插入身份确认和富集定量，但详细ORF文库序列验证研究很少，且常依赖旧测序/分析方法或未解析变异；近期编码和非编码文库仍依赖部分Sanger验证，ORF文库也常未经独立验证直接使用。研究人员将常规ORF文库验证受限归因于缺乏覆盖文库制备、测序和变异识别的成本有效、可扩展NGS流程。PPLseq通过整合序列唯一性映射、池化文库制备及参考和新文库表征，建立无条形码蛋白质超家族NGS；唯一性分析显示仅少量ORF（尤其异构体和旁系同源基因）超出≥150循环短读长NGS范围；实验上无需条形码或可能扭曲文库代表性的PCR，并在参考文库上实现完整回收和高准确度。研究认为>1,000×平均测序覆盖深度可作为捕获大多数ORF的起点，PPLseq在验证原型池全部ORF时成本低于长读长方法>10倍，适用于仅以池形式保存的历史文库，并可支持Golden Gate、Gateway和同源臂文库等新文库生成。借助PPLseq，研究人员构建了据其所知最大的GPCR-FP融合文库，表达谱显示表达水平与受体类别相关，并可识别具高效膜定位或研究不足的受体。局限包括：需已知ORF序列，不适用于内容先验未知的文库；短读长限制异构体或其他含非唯一片段ORF的解析；未评估替代比对和变异识别方法。
研究结论翻译：尽管蛋白质及其复合物日益增多的结构特征可从序列中计算推断，但迄今仍需要原位实验才能详细理解蛋白质功能、分子相互作用和细胞定位。阐明整个蛋白质超家族的功能特性仍具挑战性，并需要高通量方法。研究人员提出一种测序流程，为在蛋白质组分析及更广泛领域大规模利用大型且灵活的编码和非编码序列文库奠定基础。
