Sw71 TWIST1敲除囊胚样模型揭示胚胎植入受损机制

《Current Issues in Molecular Biology》：Sw71 TWIST1 Knockout Model for Impaired Embryo Implantation

　　

成功的人类植入依赖于绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast，EVT）对母体蜕膜的精确而充分的侵袭。TWIST1转录因子在该过程中的作用尚未完全明确。在人类中，EVT功能缺陷与重大产科综合征相关。由于缺乏可靠的体外模型，对基于TWIST1的植入受损的理解受到限制。为弥补这一空白，研究人员将对健康与流产妊娠组织中TWIST1表达的离体（ex vivo）分析与体外Sw71 TWIST1-CRISPR/Cas9敲除人囊胚样替代物（Sw71TW1-KO BLS）相结合。研究人员发现，在健康妊娠的母胎界面存在TWIST1强表达，而在稽留流产妊娠中则无此强表达。所生成的Sw71TW1-KO BLSs保留了囊胚样形态，但必需的HLA-G和HLA-C分子的表达降低。通过迁移和侵袭实验评估了Sw71TW1-KO BLSs的功能。Sw71TW1-KO BLSs表现出明显受损的迁移。当置于Matrigel包被的子宫内膜基质细胞支架上时，Sw71TW1-KO BLSs未能侵袭该支架。结果支持TWIST1是人类妊娠早期健康蜕膜和胎盘的重要组成成分。具有亚最佳HLA表达和功能受损的3D模型Sw71TW1-KO BLSs可作为研究TWIST1相关滋养细胞缺陷的工具。

人类胚胎植入是一个效率较低的过程，约30%的自然胚胎植入成功率使其成为妊娠建立的关键限速步骤。植入失败和流产多发生在围植入期，但由于该时期难以检测，临床干预受到很大限制。胚胎植入的关键环节是滋养细胞分化为合体滋养细胞（syncytiotrophoblast，STB）、细胞滋养细胞（cytotrophoblast，CTB）和绒毛外滋养细胞（extravillous trophoblast，EVT）。其中EVT具有高度侵袭性，能侵入蜕膜和子宫肌层内1/3，重塑螺旋动脉，建立母胎循环。EVT侵袭不足可导致胎盘浅着床，进而引发胎儿生长受限、自然流产或子痫前期（preeclampsia，PE）等重大产科综合征。因此，阐明调控EVT迁移和侵袭的分子机制对理解健康妊娠的建立至关重要。
TWIST1是一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子，参与中胚层形成、神经嵴细胞迁移以及上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）的诱导，并在肿瘤转移和生理性EVT侵袭中发挥重要作用。已有报道指出TWIST1下调与流产和子痫前期相关。然而，由于缺乏可靠的体外模型，TWIST1在人类植入中的具体功能仍不明确。为此，研究人员将离体（ex vivo）分析与3D体外模型相结合，探究TWIST1在EVT分化与功能中的作用。研究结果显示，TWIST1在正常妊娠早期蜕膜和胎盘中强表达，而在稽留流产组织中表达显著减弱；敲除TWIST1的Sw71囊胚样替代物（blastocyst-like surrogate，BLS）虽保持形态，但HLA-G和HLA-C表达下降，迁移和侵袭能力严重受损。这提示TWIST1是健康妊娠建立的重要分子，所构建的3D模型可用于研究TWIST1相关滋养细胞缺陷。
研究人员采用的关键技术方法包括：对来自保加利亚大学妇产医院“Maichin Dom”的7例正常早期妊娠（6–12周）和7例年龄匹配稽留流产（6–12周）患者妊娠组织进行组织学和免疫组织化学检测，并用半定量免疫反应评分（immunoreactive score，IRS）评估TWIST1表达；利用CRISPR/Cas9构建Sw71 TW1-KO细胞系（由Dr. Mor实验室提供），通过Western blot确认蛋白缺失；在超低附着板中离心培养形成3D BLS；用时间序列成像系统监测球体形成、迁移和侵袭；通过间接免疫荧光检测HLA-G/HLA-C表达并测量平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）；使用GraphPad Prism进行统计分析和多重比较。这些方法实现了对TWIST1功能的多维度评估。
研究结果如下：
3.1 TWIST1在健康母胎界面强表达，而在稽留流产中表达显著减弱。免疫组化显示，正常妊娠蜕膜腺上皮细胞、胎盘绒毛滋养细胞以及侵入蜕膜的EVT均呈强TWIST1信号，而稽留流产组织中蜕膜和胎盘绒毛的TWIST1反应很弱，甚至仅单个腺体细胞阳性，且蜕膜中有大量淋巴细胞浸润。IRS评分显示两组差异显著。
3.2 Sw71 TWIST1-KO细胞系的验证。Western blot检测多个传代的TW1-KO细胞均未检测到TWIST1蛋白，而野生型（wild-type，WT）细胞有表达，证实了基因敲除后的蛋白缺失，可用于后续功能实验。
3.3 3D TWIST1敲除Sw71 BLS的生成和形态。在超低附着板中培养48小时后，TW1-KO和WT球体均形成致密的多层圆形结构，两者直径（中位数0.370 mm）和表面积（0.110 mm²）无显著差异。TW1-KO球体边缘不如WT完整，但仍能稳定转移，说明TWIST1缺失不影响球体形成。
3.4 TW1-KO BLS模型的HLA图谱。免疫荧光染色显示，迁移中的TW1-KO EVT样细胞中HLA-G和HLA-C的平均荧光强度显著低于WT（HLA-G：1.20±0.83 vs 2.90±1.13，p<0.05；HLA-C：0.07±0.18 vs 0.91±0.55，p<0.001），表明TWIST1缺失导致重要免疫耐受分子表达下调。
3.5 Sw71 TW1-KO球体迁移明显受损。在Opti-MEM最佳条件下，仅39%的TW1-KO球体出现迁移，且迁移区较小（0.730 mm²），而94%的WT球体形成大且清晰的迁移区（1.600 mm²）。血清饥饿条件下，TW1-KO迁移率降至18%，WT为86%；迁移区分别为0.644 mm²和1.280 mm²。结果表明TWIST1缺失严重损害EVT样细胞的迁移能力和效率。
3.6 Sw71 TW1-KO替代物的侵袭被阻断。在Matrigel包被的子宫内膜基质细胞（human endometrial stromal cell，HESC）支架上培养6天，WT球体形成大量长而厚的侵袭足样突起，侵袭面积于第6天达0.38±0.14 mm²；而TW1-KO球体仅有少量细短突起，侵袭面积仅0.07±0.11 mm²，且常伴大量凋亡细胞。在子宫内膜上皮细胞（HEC-1A）支架的非促进条件下，TW1-KO和WT球体均不能侵袭（面积分别为?0.012±0.03和0.003±0.035 mm²），说明TWIST1依赖的侵袭需要在间质细胞微环境中实现。
讨论部分指出，TWIST1在正常妊娠早期蜕膜和胎盘中的强表达与既往研究一致，其表达下调与流产和PE相关。TWIST1可能通过炎症反馈环路和EMT调控EVT功能，并通过间接机制调节HLA-G/HLA-C表达，例如经IRF9或下游信号通路；此外，TWIST1还参与细胞存活，因为TW1-KO球体在饥饿条件下活力降低。研究局限性包括缺乏拯救实验、侵袭结构验证不足以及手动评估耗时等。研究结论部分翻译如下：转录因子TWIST1是人类妊娠早期健康蜕膜和胎盘的重要组成成分。本研究表明，在Sw71 EVT样细胞中删除TWIST1基因保留了球体的形成，但导致必需的HLA分子表达降低并影响EVT功能。3D Sw71 TWIST1敲除人囊胚样替代物为TWIST1参与滋养细胞功能提供了新见解，并可能成为研究TWIST1相关信号通路及受损（浅）EVT侵袭的潜在体外模型。