《Current Issues in Molecular Biology》：Intranasal Delivery of Dental Stem-Cell-Derived Extracellular Vesicles Improves Blood–Brain Barrier Integrity Following Ischemic Stroke by Alleviating Oxidative Stress
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缺血性脑卒中是一种致残性神经血管疾病，以脑部血液供应的局灶性中断为特征。目前的临床干预措施旨在恢复脑循环，然而神经损伤后的功能恢复仍不理想。间充质干细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是神经系统疾病的重要治疗制剂。值得注
缺血性脑卒中是一种致残性神经血管疾病，以脑部血液供应的局灶性中断为特征。目前的临床干预措施旨在恢复脑循环，然而神经损伤后的功能恢复仍不理想。间充质干细胞来源的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是神经系统疾病的重要治疗制剂。值得注意的是，由于牙源性干细胞来源的细胞外囊泡（dental stem cell-derived extracellular vesicles，DSC-EVs）与神经嵴在发育上具有相似性，被认为是具有前景的治疗制剂。在大鼠缺血性脑卒中模型中，鼻内给予DSC-EVs相较于骨髓和脂肪组织来源的细胞外囊泡表现出更显著的治疗效果。这种非侵入性鼻内给药途径在不需全身注射的情况下增加了可检测的脑相关荧光信号。在功能上，DSC-EVs通过减小梗死面积和恢复血脑屏障（blood–brain barrier，BBB）完整性改善了神经功能恢复。在机制上，富含miR-21-5p的DSC-EVs减轻了脑微血管内皮细胞的氧化应激，可能通过下调S100A10表达从而维持紧密连接完整性。研究结果揭示了DSC-EVs在缺血性脑卒中中显著的治疗潜力，并提出鼻内递送的DSC-EVs通过调节S100A10相关内皮氧化应激来减轻缺血再灌注诱导的血脑屏障破坏的机制，支持DSC-EVs作为脑卒中后神经血管修复的非侵入性方法进行进一步的临床前评估。
研究背景与科学问题
缺血性脑卒中是全球范围内导致长期残疾和死亡的主要原因，其核心病理特征为脑部血液供应的局灶性中断。尽管溶栓和血管内介入治疗显著改善了急性缺血性脑卒中患者的预后，但再灌注后神经血管损伤的修复策略仍然匮乏。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）因其强大的再生和免疫调节特性而受到广泛关注，其分泌组中的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）被认为是MSC疗法发挥疗效的主要机制。然而，不同来源MSC来源的EVs在分子组成和治疗效力上存在显著异质性，这给临床应用带来了挑战。既往研究已表明，牙源性干细胞来源的细胞外囊泡（DSC-EVs）具有优异的脑靶向特性、对神经组织的强亲和力以及丰富的神经相关蛋白，但其是否优于传统MSC来源的EVs以及潜在机制尚不明确。因此，本研究旨在系统比较不同MSC来源EVs在缺血性脑卒中模型中的治疗效力，并阐明DSC-EVs发挥优越疗效的分子机制。
研究内容与主要结论
研究人员在实验性缺血性脑卒中大鼠模型中系统比较了骨髓间充质干细胞来源EVs（BMMSC-EVs）、脂肪间充质干细胞来源EVs（ASC-EVs）和DSC-EVs的治疗效果。结果显示，DSC-EVs在改善神经功能、减小梗死体积和恢复血脑屏障（BBB）完整性方面均优于其他两种EVs。机制上，DSC-EVs优先与缺血脑组织中的脑微血管内皮细胞（BMECs）相互作用，通过递送富集的miR-21-5p靶向抑制S100A10表达，从而减轻内皮细胞的氧化应激，保护紧密连接蛋白Claudin-5的表达，最终维持BBB完整性。该研究首次揭示了miR-21-5p/S100A10调控轴在DSC-EVs抗氧化和屏障保护效应中的关键作用，为缺血性脑卒中的非侵入性细胞外囊泡治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。
关键技术方法
研究人员从健康志愿者（骨髓和脂肪组织供者年龄22–40岁，n=3；牙体组织供者年龄9–11岁，n=3）获取人新鲜骨、脂肪组织和牙齿，分别分离培养BMMSCs、ASCs和DSCs。采用差速超速离心法提取EVs，并通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、动态光散射和免疫印迹进行表征。体内实验采用大鼠大脑中动脉阻塞（MCAO）模型模拟缺血性脑卒中，通过鼻内途径给予EVs治疗，运用改良神经功能缺损评分（mNSS）、圆柱体测试和胶带接触/移除测试评估神经功能恢复，采用TTC染色评估梗死体积，伊文思蓝外渗实验评估BBB通透性，免疫荧光和免疫印迹分析蛋白表达。体外实验采用氧糖剥夺（OGD）模型处理原代大鼠BMECs和人CMEC/D3细胞系，结合蛋白质组学、miRNA测序、RNase保护实验、双荧光素酶报告基因实验和XGBoost-SHAP分析阐明分子机制。
研究结果
3.1 BMMSC-EVs、ASC-EVs和DSC-EVs的功能分析：通过透射电镜、纳米颗粒跟踪分析、免疫印迹和动态光散射对三种EVs进行表征，确认其典型杯状形态、EVs标志物阳性及负表面电荷。蛋白质组学主成分分析显示三种EVs蛋白组学谱清晰分离，GO富集分析表明DSC-EVs富集蛋白涉及凝血调节、细胞连接组装和血管发育等生物学过程。细胞- EVs货物传递分析发现神经和血管功能关键调控因子（如NES、EPHA2、ITGA3）在DSC细胞及其EVs中共富集，提示DSC-EVs具有选择性富集神经保护、促血管生成和BBB稳定蛋白的特性。
3.2 DSC-EVs在缺血性脑卒中中增强的治疗效果：MCAO大鼠模型中，DSC-EV治疗组mNSS评分恢复最快，圆柱体测试和胶带接触/移除测试表现最优。TTC染色显示DSC-EV治疗组脑组织存活体积最大，梗死面积最小。结果表明DSC-EVs在改善运动和感觉功能方面优于BMMSC-EVs和ASC-EVs。
3.3 DSC-EVs优先与BMECs相互作用并维持BBB完整性：荧光追踪显示DSC-EVs信号主要与梗死周围区域的内皮细胞（CD31阳性）共定位。DSC-EV治疗显著逆转了脑组织中Claudin-5的下调表达，而对VEGF的调节作用不显著，表明DSC-EVs主要通过恢复BBB完整性而非促进血管生成发挥作用。伊文思蓝外渗实验证实DSC-EV治疗显著减少了BBB渗漏。
3.4 DSC-EVs通过降低活性氧改善BBB完整性：蛋白质组学分析显示DSC-EV处理显著改变OGD处理BMECs的蛋白表达谱，GO富集分析表明氧化解毒和过氧化氢分解代谢通路显著上调。DCFH-DA和MitoSOX Red染色证实DSC-EVs显著减轻OGD诱导的ROS产生。XGBoost-SHAP分析将S100A10列为与紧密连接恢复相关的首要候选分子。免疫印迹证实OGD诱导S100A10上调，而DSC-EV处理显著抑制其表达。S100A10敲低显著减少OGD诱导的ROS积累。
3.5 DSC-EVs递送miR-21-5p通过抑制S100A10表达增强BMEC抗氧化：miRNA测序鉴定miR-21-5p为DSC-EVs中富集且预测靶向S100A10的候选miRNA。RNase保护实验确认miR-21-5p受EV膜结构保护。DSC-EV处理后受体内皮细胞中miR-21-5p水平升高。序列比对和双荧光素酶报告基因实验证实miR-21-5p直接靶向S100A10 3′UTR。干预实验表明抑制miR-21-5p减弱DSC-EV介导的ROS降低效应，而沉默S100A10可恢复抗氧化效果。
讨论与结论
讨论部分指出，DSC-EVs的优越疗效可能与其胚胎起源（与神经嵴发育相似）有关，且牙髓组织富含神经和血管分布的环境可能赋予DSC-EVs独特的神经血管保护特性。DSC-EVs中Clusterin（CLU）和EPHA2等蛋白的选择性富集可能协同miR-21-5p/S100A10轴共同发挥内皮保护作用。与BMMSC-EVs和ASC-EVs通过促进血管生成恢复BBB不同，DSC-EVs主要通过减轻内皮氧化应激和恢复紧密连接来保护BBB。乳牙作为临床常规丢弃的组织，为DSC-EVs提供了伦理上无争议且非侵入性的来源。研究局限性包括OGD模型不能完全模拟体内缺血再灌注损伤、样本量较小且仅使用雄性大鼠、超速离心法可能混入其他囊泡成分、缺乏体内S100A10干预实验以及缺乏长期随访评估安全性。
结论部分总结：DSC-EVs在鼻内递送后对实验性缺血性脑卒中的治疗效力优于BMMSC-EVs和ASC-EVs，其作用与通过miR-21-5p依赖性机制维持血脑屏障完整性和减少S100A10相关氧化应激有关。这些发现支持DSC-EVs作为一种功能独特的MSC-EV亚型值得进一步临床前评估，并提示miR-21-5p/S100A10轴可作为缺血损伤后神经血管保护的可操作治疗靶点。
