《Current Issues in Molecular Biology》：Production and Functional Characterization of Recombinant Eel Follicle-Stimulating Hormone Using an hCG β-Subunit Carboxyl-Terminal Peptide and a Flexible GGSA Linker
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本研究旨在开发一种具有修饰O-连接糖基化的糖工程重组鳗鱼促卵泡激素（rec-eel FSH），并利用中国仓鼠卵巢DG44（CHO DG44）细胞建立稳定的哺乳动物细胞生产平台。为引入额外的潜在O-连接糖基化位点，将人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCG β）的羧基末
本研究旨在开发一种具有修饰O-连接糖基化的糖工程重组鳗鱼促卵泡激素（rec-eel FSH），并利用中国仓鼠卵巢DG44（CHO DG44）细胞建立稳定的哺乳动物细胞生产平台。为引入额外的潜在O-连接糖基化位点，将人绒毛膜促性腺激素β亚基（hCG β）的羧基末端肽（CTP）区域（氨基酸115–145）插入野生型单链鳗鱼FSH（FSH-wt）的β亚基和α亚基之间。此外，在FSH β亚基和hCG β亚基CTP区域之间引入一个15个氨基酸的柔性连接子[(GGSA)3GGG]，以改善CTP序列的结构可及性，构建了FSH-GGSA-hM-Strep表达载体。FSH-GGSA-hM-Strep在CHO DG44细胞中稳定表达，并通过Strep-Tactin XT亲和色谱纯化。蛋白质印迹和银染色显示表观分子量约为54–57 kDa的异质性宽条带，与广泛翻译后修饰一致。使用PNGase F、O-糖苷酶和神经氨酸酶进行酶促去糖基化显著降低了表观分子量，表明N-连接和O-连接聚糖及末端唾液酸残基对重组激素分子量增加和分子异质性有重要贡献。功能表征证实FSH-GGSA-hM-Strep具有生物学活性，并通过鳗鱼FSH受体引起剂量依赖性反应。受体刺激诱导快速、短暂的ERK1/2磷酸化，在5 min达到峰值，而用H89抑制PKA显著减弱了这种早期反应，支持cAMP/PKA依赖性信号通路参与ERK1/2激活。此外，β-arrestin 1缺失改变了ERK1/2激活的时间模式，PKA抑制消除了早期反应并揭示了延迟的ERK1/2磷酸化，提示存在时间上不同的PKA依赖性和β-arrestin相关信号机制。这些发现表明，将柔性[(GGSA)3GGG]连接子与hCG β亚基CTP序列结合是生成具有工程化糖基化相关分子异质性的结构修饰重组鳗鱼FSH的有效策略。稳定CHO DG44生产细胞的建立为生物活性糖工程鳗鱼FSH的规模化生产提供了潜在平台。
研究背景方面，糖蛋白激素的分子特征受复杂结构组织和翻译后修饰特别是糖基化程度的影响显著，糖基化可影响分子大小、稳定性和异质性。促卵泡激素（FSH）是调控性腺发育、成熟和配子发生的关键生殖糖蛋白激素。鳗鱼FSH α亚基含有两个保守的N-连接糖基化位点（Asn56和Asn79），β亚基含有另外两个位点（Asn5和Asn22）。除N-连接糖基化外，O-连接糖基化是重要的翻译后修饰，可调节蛋白质构象稳定性、分子相互作用和生物学活性。近年来，多项研究致力于通过引入天然FSH中不存在的额外O-连接糖基化位点来开发新型FSH类似物。基于CTP的糖工程策略已在长效蛋白治疗药物开发中显示潜力，如hCG β亚基CTP区域融合已成功应用于长效蛋白治疗药物开发。此前研究报道在CHO-DG44细胞中生产的重组日本鳗鱼FSH和LH可完全诱导卵巢发育。因此，将富含O-糖基化的CTP序列引入重组FSH可能为开发具有修饰分子和功能特性的新型类似物提供有效策略。本研究旨在通过引入hCG β亚基来源的CTP区域，建立具有修饰O-连接糖基化的重组日本鳗鱼FSH的大规模生产系统。为进一步促进O-连接糖基化，在CTP区域上游引入柔性GGSA连接子，并利用CHO-DG44细胞建立稳定的高产单细胞克隆用于大规模重组蛋白生产和纯化。随后评估纯化重组鳗鱼FSH的理化和糖基化特征，并利用表达日本鳗鱼FSH受体（FSHR）的细胞评估其生物学活性，进一步研究受体介导的信号传导特性，重点关注cAMP/PKA依赖性ERK1/2激活和β-arrestin 1（β-Arr1）在ERK1/2磷酸化中的作用。
研究人员开展的研究主要包括：构建了FSH-GGSA-hM-Strep/His和FSH-GGSA-hGM-CSF-Strep表达载体，在CHO-K1和CHO-S细胞中进行瞬时表达评估，在CHO-DG44细胞中进行稳定转染并通过递增浓度甲氨蝶呤（MTX）进行基因扩增，通过有限稀释法进行单细胞克隆化，筛选约100个克隆获得5个高表达克隆，最终选择克隆#7和#20用于大规模生产。利用ELISA测定培养上清中重组蛋白浓度，通过Strep-Tactin XT和HisPur Ni-NTA亲和色谱纯化重组蛋白，采用蛋白质印迹和银染色分析蛋白纯度和分子量，通过酶促去糖基化（PNGase F、O-糖苷酶和神经氨酸酶）分析糖基化特征。利用HTRF法测定cAMP积累评估生物学活性，通过CRISPR/Cas9技术构建β-Arr1敲除（KO）细胞系，通过蛋白质印迹检测ERK1/2磷酸化水平。研究结论表明，利用GGSA连接子和hCTP序列的单链表达系统成功生产了具有生物学活性的重组鳗鱼FSH，N-连接和O-连接聚糖对重组蛋白分子量增加有重要贡献，建立的稳定高产CHO-DG44单细胞克隆可用于大规模生产，纯化的重组鳗鱼FSH可有效激活鳗鱼FSHR并以剂量依赖性方式诱导cAMP积累，早期ERK1/2反应主要通过cAMP/PKA信号通路介导，β-Arr1缺失显著损害ERK1/2激活的快速和持续阶段，表明β-Arr1在鳗鱼FSHR介导的ERK信号中发挥重要作用。该研究的重要意义在于证明了基于GGSA-hCTP的表达策略能够高效生产糖基化且具有生物学活性的重组鳗鱼FSH，并为PKA依赖性和β-Arr1依赖性信号通路在鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活中的协调作用提供了新见解，同时建立的稳定CHO DG44生产细胞为生物活性糖工程鳗鱼FSH的规模化生产提供了潜在平台。
关键技术方法方面，研究人员采用重叠延伸PCR构建单链鳗鱼FSH表达载体，利用脂质体转染法将线性化表达载体转染CHO-DG44细胞，通过递增浓度MTX进行基因扩增和有限稀释法进行单细胞克隆化筛选高产克隆，利用Strep-Tactin XT亲和色谱纯化重组蛋白，采用蛋白质印迹和银染色进行蛋白分析，通过PNGase F、O-糖苷酶和神经氨酸酶进行酶促去糖基化分析，利用HTRF法测定cAMP水平评估生物学活性，通过CRISPR/Cas9技术构建β-Arr1 KO细胞系，通过蛋白质印迹和密度定量分析检测ERK1/2磷酸化。样本来源为日本鳗鱼垂体cDNA用于扩增FSH α和β亚基cDNA，CHO-K1、CHO-S和CHO-DG44细胞用于表达，HEK293细胞用于受体信号传导研究。
研究结果方面，第一，重组鳗鱼FSH-GGSA-hM-Strep/His蛋白的生产与纯化：在CHO-K1和CHO-S细胞中瞬时表达重组蛋白，FSH-GGSA-hM-Strep通过Strep-Tactin XT亲和色谱成功纯化，在组分3和4检测到宽而强的条带；FSH-GGSA-hM-His未能通过抗His抗体检测到，但用抗鳗鱼FSH β亚基抗体在流穿组分中确认了其存在，提示His标签可能因结构变化而难以被抗体识别。第二，重组鳗鱼FSH-GGSA-hM-Strep和FSH-GGSA-hGM-CSF-Strep的去糖基化：FSH-GGSA-hM-Strep显示约54–57 kDa的宽条带，PNGase F处理后分子量显著降低至约40 kDa，O-糖苷酶处理也导致分子量降低，神经氨酸酶处理降低至约42 kDa，表明N-连接和O-连接聚糖及末端唾液酸残基均贡献于分子量；FSH-GGSA-hGM-CSF-Strep显示约51–54 kDa，PNGase F处理后降低至约37 kDa，O-糖苷酶或神经氨酸酶处理后约40 kDa，提示FSH-GGSA-hM-Strep可能经历更广泛的O-连接糖基化。第三，表达鳗鱼FSH-GGSA-hM-Strep蛋白的单细胞分离：从MTX扩增的CHO-DG44细胞中分离单细胞克隆，筛选约100个克隆获得5个稳定克隆，克隆#7和#20显示最高表达水平，克隆#7在第7天信号最强，克隆#20在第9天表达最高，两个克隆在1-L旋转培养瓶中培养至5 L，最终产量为10–12 mg/L，回收约6.7 mg/L，回收效率约60%。第四，纯化与银染色结果：从克隆#7和#20各收集约5 L培养上清，经Strep-Tactin XT 4Flow高容量柱纯化，组分2信号最强，组分3也有明显但较弱的条带，纯化重组蛋白显示约54–57 kDa的宽条带，银染色显示纯化前浓缩培养上清中存在多条蛋白条带，纯化后仅检测到重组蛋白，与先前报道的含eCTP连接子的重组蛋白（GGSA-eM-Strep）相比，含hCTP序列的构建体表观分子量略有增加。第五，重组鳗鱼FSH-GGSA-hM-Strep蛋白的生物学活性：利用瞬时表达鳗鱼FSH受体的CHO-K1细胞评估体外生物学活性，rec-eel FSH-GGSA-hM-Strep以剂量依赖性方式诱导cAMP积累，EC50值为220.7 ng/mL，最大反应（Rmax）为40.2 ± 0.9 nM/10?细胞，表明其有效激活表达鳗鱼FSH受体的CHO-K1细胞中的cAMP产生。第六，鳗鱼FSHR介导的PKA依赖性ERK1/2激活：在转染鳗鱼FSHR的对照细胞中，ERK1/2磷酸化迅速增加，5 min达到最大值，随后30 min内逐渐下降，15和30 min时pERK1/2活性分别降至5 min水平的约50%和22%；H89预处理显著减弱ERK1/2磷酸化，5和15 min时pERK1/2活性分别约为对照的64%和50%，30 min时几乎完全消除；PKC抑制剂GFX对ERK1/2磷酸化影响很小，表明ERK1/2激活主要与cAMP/PKA信号通路相关。第七，β-Arr1依赖性ERK激活的调节：利用CRISPR/Cas9系统构建β-Arr1 KO细胞，19个克隆中13个显示β-Arr1蛋白表达完全缺失；在β-Arr1 KO细胞中，鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活显著减弱，5 min早期反应降至对照的约40%，持续或晚期ERK1/2活性几乎完全消除；PKC抑制剂处理未产生明显额外降低；在β-Arr1 KO细胞中，H89处理完全消除5 min的ERK1/2磷酸化，但15和30 min时ERK1/2磷酸化重新出现并显著增加，15 min时增加约20%，30 min时增加超过4倍；GFX处理在5 min时显著增加ERK1/2磷酸化，总体时间模式与对照细胞基本相当。这些发现揭示了β-Arr1 KO细胞中ERK1/2调节的独特时间依赖性模式，即PKA抑制抑制早期ERK1/2反应但伴随晚期ERK1/2反应增强，表明在缺乏β-Arr1的情况下，鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活早期阶段似乎依赖PKA，而晚期ERK1/2反应可能涉及PKA非依赖性信号机制。
讨论部分总结：本研究将hCTP区域引入重组日本鳗鱼FSH作为潜在修饰O-连接糖基化的策略，并引入[(GGSA)3GGG]连接子以潜在促进hCTP区域内的O-连接糖基化。该糖工程策略促进了高效可扩展生产平台的开发，允许从单细胞衍生克隆大规模生产重组鳗鱼FSH。本研究中产生的重组蛋白表现出适当的N-连接和O-连接糖基化以及唾液酸修饰，如酶促去糖基化分析所示。重组蛋白在表达FSHR的细胞中显示浓度依赖性生物学活性增加，并有效诱导ERK1/2磷酸化。值得注意的是，PKA抑制剂H89处理和β-Arr1 KO细胞显著影响pERK1/2激活，提示PKA和β-Arr1依赖性机制均参与FSHR介导的ERK1/2信号传导。与先前研究相比，本研究在构建体设计和蛋白纯化方面存在差异：先前研究使用C端His标签、[(GGGS)3GGG]连接子和Ni-NTA固定化金属亲和色谱，而本研究采用C端GGSA-Strep标签、[(GGSA)3GGG]连接子和Strep-Tactin亲和色谱。近年来，糖蛋白激素β亚基中特异性O-连接聚糖的功能意义日益受到关注，重组hCG和eCG中O-连接糖基化的重要作用已被越来越多地认识。本研究中hCTP的引入与比eCTP更大的表观分子量相关，尽管后者据报道含有12个潜在O-连接糖基化位点，而hCTP据报道含有四个潜在O-连接糖基化位点（S121、S127、S132和S138）。银染色结果显示GGSA-hM-Strep比GGSA-eM-Strep表观分子量高约2 kDa，尽管hCTP中潜在O-连接糖基化位点相对较少，但hCTP似乎比eCTP更有效地促进糖基化。此外，GGSA-hM-His重组蛋白未能被抗His抗体检测到，可能是由于翻译后糖基化和蛋白质折叠相关的构象变化影响了抗体对His标签的识别。本研究中鳗鱼FSH-GGSA-hM-Strep显示约54–57 kDa的表观分子量，表明翻译后修饰程度显著较高；hGM-CSF-Strep也显示可检测的O-连接糖基化，但修饰程度似乎低于含hM的构建体；GGSA-hM-Strep的O-糖苷酶处理导致表观分子量显著降低，降低幅度与PNGase F处理后观察到的相当。研究人员承认从蛋白质印迹和银染色推断的分子量是近似的，不代表精确的分子量测量；由于本研究发现是从酶促去糖基化分析结果推断的，O-连接糖基化的改变主要基于间接生化证据；尽管结果提示O-连接糖基化的可能改变，但缺乏适当的比较物使得难以确定这种变化是否可特异性归因于GGSA连接子的添加。这些结果与近期报道的长效重组蛋白开发研究一致，包括人FSH、牛FSH、猪FSH、人干扰素-α2b和促红细胞生成素，这些研究共同强调了糖工程和融合策略改善重组蛋白药理学特性的潜力。在猪FSH中，通过柔性[G4S]3连接子将β亚基与Fc结构域融合可增强生物学活性并延长循环半衰期；同样，近期关于引入hCTP的人FSH研究显示六个位点发生O-连接糖基化，而非先前认为的四个位点，进一步突显了hCTP序列的巨大糖基化潜力。鉴于这些发现，本研究结果表明引入柔性(GGSA)3GGG连接子可能通过增加hCTP序列的结构灵活性和对细胞O-糖基化机制的可及性来促进其有效的O-连接糖基化。值得注意的是，含hCTP的构建体在本研究中表现出比含eCTP的相应构建体略高的表观分子量，尽管仅凭表观分子量差异不能提供糖基化程度的明确证据，但这一观察连同糖苷酶消化谱提示hCTP可能以不同于eCTP的方式影响rec-eel FSH的糖基化特征。随着O-连接聚糖在治疗性蛋白中的功能意义日益被认识，O-连接糖基化已成为改善重组糖蛋白治疗药物药理学特性的重要策略，在此背景下，含有多个潜在O-糖基化位点的hCTP可能对延长重组糖蛋白的循环半衰期和作用持续时间特别有价值。ERK1/2磷酸化已被认为是GPCR激活下游的重要信号事件。本研究中鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活在早期阶段被PKA抑制剂H89显著抑制，表明PKA信号在鳗鱼FSHR下游ERK1/2早期激活中发挥重要作用，这与先前显示H89处理显著抑制β2-肾上腺素能受体和人类FSHR介导的早期ERK1/2激活的研究一致。相反，鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活在很大程度上不受PKC抑制剂处理的影响，这些发现共同表明鳗鱼FSHR下游的ERK1/2激活主要通过PKA依赖性而非PKC依赖性途径介导。本研究中β-Arr1 KO导致早期ERK1/2激活降低60%以上，晚期ERK1/2激活完全丧失；在β-Arr1 KO细胞中H89处理完全消除早期ERK1/2激活，而晚期ERK1/2激活反常增加，这些发现提示H89在反应早期阶段对PKA依赖性信号发挥抑制作用，尽管其在β-Arr1 KO细胞后期时间点的作用仍不清楚。在β-Arr1 KO克隆中，不能排除受体表达差异和克隆特异性效应，特别是因为仅分析了一个克隆。这些观察与先前研究人类FSHR和甲状旁腺激素受体介导的ERK1/2信号中β-Arr1参与的研究基本一致。β-arrestins是GPCR信号的多功能调节因子，与多种信号蛋白相互作用并在受体激活后协调多个下游通路，这些动态相互作用使β-arrestins能够根据激活的受体和细胞信号环境采用不同的构象状态，从而促成受体特异性信号反应。总之，本研究结果表明鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活通过不同的信号机制在时间上受到调节，PKA依赖性信号在早期阶段似乎发挥主要贡献，而β-Arr1可能在维持晚期ERK1/2激活中发挥更突出的作用。在β-Arr1 KO细胞中，H89处理意外增加了30 min时FSH诱导的ERK1/2磷酸化，尽管潜在机制仍不清楚，但这种增加可能与PKA依赖性反馈调节的改变或替代/补偿性信号通路的激活有关，如G蛋白βγ亚基或受体酪氨酸激酶转激活介导的通路；然而，在解释这些发现时也应考虑H89的潜在脱靶效应。β-Arr1 KO细胞中H89处理后晚期ERK1/2激活的反常增加可能反映了可能的补偿性信号机制的参与，β-Arr1介导信号的同步丧失和PKA通路的抑制可能将鳗鱼FSHR信号重定向至能够激活ERK1/2的替代通路，这种意外反应提出了PKA、β-arrestin和其他GPCR相关信号通路在ERK1/2激活时间调节中可能存在串扰的可能性。需要进一步研究采用选择性药理学抑制剂和靶向替代信号组分的遗传学方法来确定这种晚期ERK1/2激活的分子机制。
研究结论部分翻译：本研究利用包含GGSA连接子和hCTP序列的单链表达系统成功生产了具有生物学活性的重组鳗鱼FSH。重组蛋白通过亲和色谱有效纯化，尽管His标签未被抗His抗体有效识别。去糖基化分析表明N-连接和O-连接聚糖均对rec-eel FSH-GGSA-hM-Strep分子量增加有重要贡献。成功建立了稳定高产的CHO-DG44单细胞克隆并用于重组鳗鱼FSH的大规模生产。使用Strep-Tactin XT亲和色谱纯化获得高度富集的重组蛋白，表观分子量约为54–57 kDa。纯化的重组鳗鱼FSH有效激活鳗鱼FSHR并以剂量依赖性方式诱导cAMP积累，证实其生物学活性。鳗鱼FSHR刺激还诱导快速ERK1/2磷酸化，最大激活发生在5 min。药理学抑制实验表明早期ERK1/2反应主要通过cAMP/PKA信号通路介导，而PKC影响很小。此外，β-Arr1缺失显著损害ERK1/2激活的快速和持续阶段，表明β-Arr1在鳗鱼FSHR介导的ERK信号中发挥重要作用。然而，H89诱导的ERK1/2激活增加可能反映了β-Arr1 KO细胞中补偿性信号通路的激活。总之，这些发现表明基于GGSA-hCTP的表达策略能够高效生产糖基化且具有生物学活性的重组鳗鱼FSH，并为PKA依赖性和β-Arr1依赖性信号通路在鳗鱼FSHR介导的ERK1/2激活中的协调作用提供了新见解。
