《Journal of Bacteriology》：Phage N4 uses a SAR endolysin-holin system for host cell lysis
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噬菌体（bacteriophages, phages）通过主动裂解宿主细胞来终止感染并将子代释放到环境中。然而，某些噬菌体在特定条件下具有延迟裂解的系统，从而增加子代产量：这种现象称为裂解抑制（lysis inhibition, LIN）。已知两种不同的大肠埃
噬菌体（bacteriophages, phages）通过主动裂解宿主细胞来终止感染并将子代释放到环境中。然而，某些噬菌体在特定条件下具有延迟裂解的系统，从而增加子代产量：这种现象称为裂解抑制（lysis inhibition, LIN）。已知两种不同的大肠埃希菌（Escherichia coli）噬菌体表现出LIN：T4和N4。在T4中，多蛋白机制在噬菌体群体密度较高的超感染条件下停滞裂解并维持LIN状态。然而，负责T4裂解和LIN的裂解蛋白与噬菌体N4并不保守。在本研究中，研究人员通过分子和遗传学手段表征了参与裂解的噬菌体N4蛋白。研究人员通过异源表达和互补实验确定了裂解所需最小基因集的功能。此外，通过与不诱导LIN的选定突变体文库进行序列比较，研究人员鉴定了参与N4 LIN的裂解盒内部及外部的基因组区域。研究人员提出了一个模型：执行快速N4裂解的裂解蛋白可受到调控以诱导LIN。尽管与T4组分缺乏保守性，本研究提示裂解起始的直接调控可能是普遍现象，并为在其他噬菌体中鉴定类似机制提供了跳板。
重要性 噬菌体是仅杀死细菌的病毒。为此，它们利用裂解蛋白破坏细菌被膜的结构组分。感染具有相似结构的细菌的噬菌体之间存在共性，但也存在有趣的差异，研究人员可以利用这些差异来深入了解特定噬菌体或其细菌宿主。在本研究中，研究人员表征了大肠杆菌噬菌体N4的裂解蛋白。结果表明，裂解调控对N4噬菌体产量的控制方式与已被充分研究的T4噬菌体不同。未来关于裂解蛋白与噬菌体产量之间关系的研究，可为临床或工业应用中优化大规模噬菌体生产提供依据。
噬菌体作为细菌病毒，其感染周期最终通过宿主细胞裂解（lysis）释放子代。尾状噬菌体普遍采用多基因裂解（multi-gene lysis, MGL）系统，包括穿孔素（holin）、内溶素（endolysin）和跨膜蛋白（spanin）等。多数噬菌体裂解迅速，但部分噬菌体可在特定条件下延迟裂解以增加子代产量，即裂解抑制（lysis inhibition, LIN）。大肠杆菌（Escherichia coli）噬菌体T4和N4均表现出LIN现象，但两者的裂解蛋白序列并不保守。T4的LIN机制已被深入解析，涉及抗穿孔素蛋白对holin的抑制，而N4的LIN遗传基础至今未被鉴定，其holin基因也仅停留在预测水平。此外，N4编码巨大的衣壳RNA聚合酶（virion RNA polymerase, vRNAP），平均爆炸量可达每细胞约3,000子代，其裂解调控可能具有独特性。因此，鉴定N4裂解系统并解析其LIN机制具有重要的科学意义。针对这一空白，研究人员开展了本研究。
研究人员通过克隆和异源表达N4预测裂解基因，证实gp60-gp63构成完整MGL裂解盒；功能表征表明gp61为SAR内溶素（signal-arrest-release endolysin），gp60/gp60a为功能性双分子spanin，gp63为pinholin，gp62为具有延迟触发活性的holin。通过快速裂解突变体筛选，鉴定到pinholin和SAR内溶素的多个突变可消除LIN，提出了N4通过直接调控裂解起始实现LIN的模型，并发现gp62可能参与LIN退出。该研究揭示了与T4机制不同的裂解调控原则，为N4样噬菌体的裂解机制研究提供了基础。
为开展研究，研究人员采用了多种关键技术方法。利用λ和hy21溶原菌系统进行异源表达和功能互补，评估各裂解基因在特定内溶素或spanin缺陷背景下的活性；使用膜去极化剂CCCP（carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone）触发人工穿孔，结合细胞活力测定区分pinholin与holin功能。通过筛选感染早期上清液（20–60分钟）获得自发快速裂解（r）突变体，并采用Sanger靶向测序与全基因组测序（Illumina或Oxford Nanopore）定位突变。突变体筛选以N4 WT为亲本，宿主菌为E. coli MG1655衍生菌株，溶原菌系统来自实验室保藏菌株。生物信息学方面，利用BLASTp/BLASTx搜索同源蛋白、CD-HIT去冗余、AlphaFold3预测结构、TMHMM与SignalP分析跨膜拓扑。
**N4预测裂解基因引起宿主快速裂解**：通过将gp60-63完整裂解盒克隆到λ晚期启动子驱动的pRE质粒并诱导表达，观察到培养物在约25分钟时发生快速裂解，证明该基因簇编码完整MGL裂解途径。缺失gp62不改变裂解表型，缺失gp63延迟裂解20分钟，gp62/gp63双缺失导致渐进裂解，表明gp63是裂解起始的主调控因子，gp62在gp63缺失时可促进爆发性裂解。
**N4编码SAR内溶素和双分子spanin**：gp61的N端存在弱疏水SAR结构域，功能互补实验显示gp61能在pinholin背景下补足细胞壁降解活性；单独表达gp61时以同步化程度低的方式缓慢导致细胞形态变化，符合SAR内溶素随机释放特征，由此鉴定gp61为SAR内溶素。gp60（i-spanin）和嵌于其内的gp60a（o-spanin）在spanin缺陷λ溶原菌中完全互补外膜破裂缺陷，证明两者为功能性双分子spanin。
**N4编码pinholin和holin**：在缺乏holin的λ或hy21溶原菌中，gp63补足了S21 pinholin缺陷但不能补足λ S105典型holin缺陷，符合pinholin形成纳米级孔洞的特征；gp62延迟触发并能补足两种背景，表现为渐进裂解。CCCP实验显示，gp63表达细胞在去极化剂处理后立即死亡，菌落形成单位（colony-forming units, CFU）下降>99%；gp62需CCCP触发才出现不可逆致死，CFU下降>98%，证明gp62为典型大孔holin但触发时间显著滞后。
**pinholin和SAR内溶素突变导致快速裂解**：通过快速裂解选择获得超过60个N4 r噬菌体。裂解盒内突变集中于gp61 SAR结构域（G12E/G13E）和gp63近跨膜结构域的LIN结构域（S62F、T65I、I70T/I70N、T71A、I72L）。将gp63 T65I和T71A突变重建到质粒裂解盒中，确认其可加速裂解。未获得gp62突变体，提示gp62不参与建立LIN。多种pinholin和SAR内溶素等位基因支持二者是控制裂解时机的关键因子。
**pinholin对裂解必需，而holin非必需**：在WT和r背景下单独缺失gp62（Δ62）不改变噬菌斑形态，但WT Δ62噬菌体裂解提前约1小时；缺失gp63（Δ63）的噬菌体在WT背景下需二次突变（常为gp61的SAR突变）才能获得可存活重组体，而在r背景下缺失gp63不影响裂解，说明gp63是条件必需基因，而gp62非必需。
**N4裂解蛋白的保守性**：BLAST检索显示，gp62和gp63在N4样噬菌体中广泛共现（60/65个分析基因组），去冗余后80个gp63同源蛋白和86个gp62同源蛋白分别显示跨膜区和LIN结构域的序列保守性，表明这两个蛋白在N4样噬菌体的裂解调控中具有普遍关联。
讨论部分指出，N4具有完整的MGL系统，由pinholin gp63、holin gp62、SAR内溶素 gp61和双分子spanin gp60/gp60a组成。研究提出模型：gp63 pinholin受到抑制导致LIN状态；gp62作为非必需holin可能通过自发或在触发后释放SAR内溶素，促进从LIN退出。与T4的可溶性抗穿孔素调控不同，N4快速裂解突变均位于膜蛋白，说明N4可能通过膜内机制而非周质蛋白相互作用调控LIN，但该假说仍需进一步验证。研究结论可翻译为：随着初级N4裂解蛋白的鉴定，本研究报道的其他快速裂解突变类别将被用于挖掘触发LIN的抑制因子。研究N4裂解与LIN之间的关系，将揭示在一小时内裂解产生典型约100至300子代/细胞、而数小时后裂解平均爆炸量约3,000子代/细胞的噬菌体中，裂解时机与产量之间关联的机制基础。未来对不同N4样噬菌体的比较研究可能揭示控制噬菌体产量的普遍与特有裂解调控原则。
