饥饿诱导的钙稳态失调与家蚕后部丝腺自噬、凋亡及组织损伤的关联研究

《Insects》：Starvation-Induced Calcium Dysregulation Is Associated with Autophagy, Apoptosis, and Posterior Silk Gland Injury in Bombyx mori

　　

家蚕（Bombyx mori）是蚕丝业的重要经济昆虫，蚕丝生产依赖营养供给与后部丝腺（posterior silk gland，PSG）发育。营养缺乏会损害家蚕PSG中丝蛋白的合成与分泌，可能影响蚕丝产量与品质。本研究探讨了饥饿诱导PSG损伤相关的细胞与分子变化。饥饿损害PSG发育并改变NADPH水平，伴随二氢乙锭（dihydroethidium，DHE）荧光增强、谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）活性升高、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性在24和48 h升高以及BmCAT转录丰度增加。透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）显示，短期饥饿与自噬结构（包括双膜自噬体和自噬溶酶体）的积累相关。相比之下，长期饥饿导致严重的超微结构损伤，特征为核膜破坏和染色质凝集。此外，逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR，RT-qPCR）和Western blotting显示自噬相关标志物表达增加以及凋亡相关变化，包括饥饿72 h后cleaved caspase-3的积累。值得注意的是，长期饥饿伴随细胞内Ca²⁺水平升高和NtATG5丰度增加，提示Ca²⁺稳态改变可能与PSG中观察到的凋亡相关反应有关。综上，这些发现鉴定了饥饿诱导PSG损伤过程中氧化还原状态、Ca²⁺稳态以及自噬和凋亡相关标志物的协同变化，为进一步机制研究和蚕丝业中食物剥夺的评估提供了基础。

家蚕（Bombyx mori）是鳞翅目模式物种，也是蚕丝业中具有重要经济价值的昆虫。丝腺合成并分泌构成蚕丝的蛋白质，由分泌丝素蛋白的后部丝腺（posterior silk gland，PSG）、分泌丝胶蛋白的中部丝腺和作为蛋白分泌管道的前部丝腺组成。丝腺在胚胎期建立并在整个幼虫期持续发育，从末龄中期开始进入快速生长阶段，其发育是受严格调控的过程。日粮差异可改变家蚕中部丝腺中丝素相关基因的表达，表明丝蛋白产生对营养状况敏感。既往研究已记录自噬和凋亡在家蚕后部丝腺退化过程中的时序性参与，但饥饿诱导PSG损伤过程中Ca²⁺稳态、自噬与凋亡之间的关系尚不清楚。自噬是响应能量短缺而激活的进化保守的分解代谢机制，是维持细胞能量稳态的重要适应性策略，受自噬相关（autophagy-related，ATG）蛋白调控。在营养限制期间，E1样酶ATG7参与ATG12–ATG5偶联系统和ATG8脂化过程，这些对自噬体形成至关重要。在哺乳动物系统中，LC3-I向脂化LC3-II的转化被广泛用作自噬标志。线粒体活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增加可导致氧化应激并促进自噬相关信号。通过磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway，PPP）等途径产生的NADPH支持谷胱甘肽（glutathione，GSH）依赖性抗氧化防御。长期饥饿期间NADPH可用性下降可能损害这些防御、扰乱细胞内氧化还原稳态并促进ROS积累。严重营养缺乏可触发从自噬向凋亡的转变。在哺乳动物系统中，凋亡可通过内源性线粒体和外源性死亡受体途径启动，最终激活caspase依赖性细胞死亡。在家蚕中，BmApaf-1介导内源性凋亡，BmDredd是凋亡相关caspase，BmDaxx调控凋亡信号，cleaved caspase-3被广泛认为是凋亡标志。细胞内Ca²⁺是自噬和凋亡的重要调节因子，但饥饿相关Ca²⁺稳态变化如何与丝腺细胞中自噬和凋亡相关反应相关联仍不清楚。作为重要的第二信使，Ca²⁺参与调控细胞存活、生长、代谢和信号转导等多个关键生理过程。在哺乳动物细胞中，Ca²⁺激活的钙蛋白酶（calpain）可切割ATG5生成促进凋亡的N端片段NtATG5，但类似的Ca²⁺–calpain–ATG5机制是否参与家蚕饥饿诱导的PSG损伤尚不清楚。本研究考察了饥饿条件下PSG超微结构、NADPH水平、氧化应激以及自噬和凋亡相关基因与蛋白的表达，并进一步检验了细胞内相对Ca²⁺水平变化是否伴随ATG5切割和凋亡相关反应。研究结果为五龄期PSG对营养剥夺的细胞反应提供了见解，并为进一步评估蚕丝业中食物剥夺的后果提供了基础。研究人员以家蚕品种Jingsong × Haoyue为材料，于五龄第2天（丝腺发育和蛋白合成的关键时期）开始禁食，对照组继续正常饲喂，于饥饿开始后24、48和72 h冰上解剖收集PSG。用于分子和生化分析的PSG以3头幼虫 pooled 构成一个生物学重复，每个处理每个时间点分析来自独立批次幼虫的3个独立生物学重复；用于RNA、蛋白和生化分析的样品储存于?80 °C。丝腺指数（silk gland index，SGI）按全丝腺重/体重×100%计算，每处理每时间点分析5头幼虫。NADPH水平采用增强型NADP+/NADPH检测试剂盒（WST-8法）于450 nm测定，并以BCA法测定的总蛋白浓度归一化。ROS采用二氢乙锭（DHE）荧光探针（5 μM）于37 °C避光孵育30 min后以DAPI复染，共聚焦显微镜（激发488 nm、发射552 nm）观察。抗氧化酶活性采用总SOD活性检测试剂盒（WST-8法，450 nm）和GST活性检测试剂盒（340 nm）测定，并以总蛋白浓度归一化。TEM分析中新鲜PSG以4%戊二醛4 °C固定2 h、1%锇酸室温后固定2 h、梯度乙醇及100%丙酮脱水、树脂包埋，超薄切片（60–80 nm）经醋酸铀和柠檬酸铅双染后于透射电镜观察；对自噬泡、受损线粒体和扩张的内质网池进行计数，归一化至细胞质面积并以每100 μm²表示，每组分析3个独立生物学重复。RT-qPCR以RNAiso Plus提取总RNA、逆转录酶及oligo(dT)引物合成cDNA，10 μL反应体系于CFX Opus系统按95 °C 2 min、40个循环（95 °C 5 s、60 °C 30 s）扩增，以2^???Ct法相对定量并以BmActin3为内参，每个生物学重复设3个技术重复。Western blotting以约100 mg PSG于含1 mM PMSF的IP裂解液中冰上匀浆，10,000× g 4 °C离心15 min取上清，BCA法定量后经SDS-PAGE分离并转至甲醇活化的PVDF膜，5% BSA室温封闭2 h、4 °C一抗过夜，TBST洗涤后室温二抗（1:1000）孵育1 h，ECL显色并以ImageJ定量，目标条带强度以Actin3归一化；所用一抗包括Actin3（1:1000）、LC3（1:300）、ATG5（1:300）、caspase-3（1:300）和Fib-L（1:300）。细胞内Ca²⁺水平以Medimachine系统机械解离获得单细胞悬液，与10 μM Fluo-3 AM于27 °C避光孵育30 min，流式细胞仪（激发488 nm、发射525 nm）每样本采集10,000个细胞，以Fluo-3 AM平均荧光强度（mean fluorescence intensity，MFI）作为细胞内Ca²⁺水平的相对指标，数据以FlowJo分析。统计学上数据以3个独立生物学重复的平均值±标准差表示，饥饿组与相应时间匹配对照组比较采用Student's t检验，p < 0.05为差异有统计学意义。结果显示：饥饿影响PSG发育，72 h时PSG明显萎缩、变窄且结构完整性受损，SGI呈下降趋势，Fib-L蛋白丰度在48和72 h显著低于相应对照组（p < 0.001）。饥饿影响PSG中NADPH水平和氧化应激，NADPH水平在24 h显著高于对照（p < 0.001），48 h无显著差异，72 h显著低于对照（p < 0.01）；共聚焦成像显示饥饿PSG中DHE衍生红色荧光增强，72 h尤为明显；SOD活性在24和48 h显著升高（均p < 0.001），GST活性在24 h（p < 0.01）、48和72 h（均p < 0.001）显著升高，BmSOD和BmCAT转录丰度在24、48和72 h均显著上调（均p < 0.001）。TEM分析显示，24 h时PSG细胞质中可见双膜自噬体和自噬溶酶体，伴轻度核膜内陷，多数线粒体保持整体形态但受损线粒体数量轻度增加；随饥饿延长，48 h核膜内陷加重和染色质凝集，72 h出现核膜破裂、染色质高度凝集、线粒体肿胀、受损线粒体和线粒体碎片增多、内质网扩张和核糖体脱落；对照组PSG细胞始终保持正常超微结构完整性。自噬泡数量在24、48和72 h均显著高于相应对照组（均p < 0.001），受损线粒体数量在24 h（p < 0.05）和72 h（p < 0.001）显著增加，扩张的内质网池在48 h（p < 0.01）和72 h（p < 0.001）显著增多。饥饿影响PSG中自噬相关标志物，BmATG5表达在24 h（p < 0.01）及48和72 h（均p < 0.001）显著上调，BmATG7在24 h（p < 0.01）和72 h（p < 0.001）显著升高，BmATG8在24、48和72 h均显著升高（均p < 0.001），LC3-II蛋白丰度在24、48和72 h均显著增加（均p < 0.001）。饥饿影响PSG中凋亡，BmApaf-1、BmDredd、BmDaxx和Bmcaspase-3转录水平在24–72 h均持续高于对照（p < 0.05），cleaved caspase-3蛋白在饥饿72 h后显著升高（p < 0.001）。饥饿诱导PSG中Ca²⁺失调和NtATG5积累，饥饿组Ca²⁺水平显著高于对照并于72 h达峰（p < 0.001），NtATG5丰度在饥饿72 h后显著增加（p < 0.001），表明长期饥饿期间细胞内Ca²⁺水平升高与NtATG5积累同时出现。讨论部分指出，PSG是负责丝蛋白生物合成与分泌的高度特化组织，其结构与功能完整性对蚕丝业至关重要，其功能高度依赖营养可用性，饥饿可能损害蚕丝生产，但饥饿诱导PSG损伤的细胞基础尚不清楚。本研究发现长期饥饿与PSG结构退化和Fib-L丰度降低相关，早期饥饿激活抗氧化防御并伴随自噬结构形成，符合早期自噬相关反应；随饥饿进展，持续氧化还原失衡伴随超微结构异常、细胞内Ca²⁺失调、NtATG5积累和凋亡相关标志物增加，提示从早期应激相关反应向更严重PSG损伤的进展。NADPH通过为抗氧化防御提供还原当量将营养代谢与氧化还原稳态联系起来，PPP破坏与NADPH水平降低和氧化应激增加相关，NADPH代谢失调与人牙周膜干细胞中ROS积累相关，类似氧化还原相关反应在暴露于环境应激的果蝇幼虫中已有报道；与此一致，饥饿24 h伴随PSG中NADPH水平升高和DHE荧光增强，并伴GST和SOD活性及BmCAT转录丰度增加，提示早期代偿反应可能暂时缓冲饥饿诱导的氧化应激。长期饥饿期间NADPH水平低于24 h时观察到的水平，而DHE荧光持续升高且多种抗氧化相关反应持续存在，提示抗氧化反应可能不足以在长期营养剥夺期间维持氧化还原稳态，由此产生的氧化还原失衡可能促进PSG损伤；自噬结构早期出现随后凋亡相关标志物增加，提示从早期自噬相关反应向更严重细胞损伤的时序性进展，NADPH可用性降低和持续氧化应激可能促进长期饥饿期间观察到的细胞损伤增加和凋亡相关变化。大量证据表明细胞内Ca²⁺超载可触发程序性细胞死亡并影响自噬与凋亡之间的平衡；本研究中长期饥饿与家蚕PSG中Ca²⁺水平升高相关，信号于72 h达峰，此时Ca²⁺升高与NtATG5和cleaved caspase-3积累以及Bmcaspase-3、BmDaxx、BmDredd和BmApaf-1转录水平升高同时出现，提示长期饥饿期间Ca²⁺稳态改变与凋亡相关反应之间存在关联。涉及Ca²⁺信号、calpain和ATG5的相关机制已在高温应激下、蛹期丝腺退化过程中以及农药暴露后的家蚕中有所描述；一种可能的解释是饥饿相关Ca²⁺升高促进calpain介导的ATG5切割，从而可能促进PSG中的凋亡，但本研究未直接检测calpain活性，也未检测Ca²⁺升高对ATG5切割的因果贡献；此外，自噬结构和自噬相关蛋白的积累不能解释为自噬通量增强。这些发现对商业蚕丝业中的饲喂管理也具有潜在意义，饥饿72 h后NADPH水平降低和严重超微结构损伤提示五龄期长期食物剥夺可能损害PSG完整性，并可能影响蚕丝生产，这些观察支持进一步评估该发育期的饲喂连续性作为影响PSG完整性的因素，但本研究未测定茧性状、蚕丝产量和蚕丝品质，食物剥夺的生产后果尚需进一步研究确定。结论部分指出，研究揭示了家蚕饥饿期间PSG结构、氧化还原相关参数以及自噬和凋亡相关标志物的时间依赖性变化：早期饥饿伴随抗氧化反应和自噬结构，而长期饥饿与NADPH水平降低、严重超微结构损伤、细胞内Ca²⁺水平升高以及NtATG5和cleaved caspase-3积累相关；这些同时发生的变化提示Ca²⁺稳态改变、ATG5切割和凋亡相关反应之间可能存在关联。这些发现增进了对PSG营养剥夺反应的理解，并为饥饿诱导组织损伤中所提出的Ca²⁺–calpain–ATG5通路的功能研究提供了基础。