《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》：Valorization of Okara by
Bacillus amyloliquefaciens Fermentation:
In Silico and
In Vitro Identification of Novel ACE Inhibitory Peptides
编辑推荐：
•Okara 通过 B. amyloliquefaciens 的发酵被转化为了新型生物活性肽。•五种肽在 体外 实验中显示出ACE抑制活性，尤其是APGYSC和CKLLL。•分子对接实验揭示了它们与ACE活性位点的稳定结合机制。•基于 计算机模拟 分析，APGYSC 被确定为潜在
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Okara 通过 B. amyloliquefaciens 的发酵被转化为了新型生物活性肽。
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五种肽在 体外 实验中显示出ACE抑制活性，尤其是APGYSC和CKLLL。
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分子对接实验揭示了它们与ACE活性位点的稳定结合机制。
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基于 计算机模拟 分析，APGYSC 被确定为潜在的候选物质，因为它具有较少的水解位点及良好的ADMET（吸收入体、分布、代谢、排泄和毒性）特性。
引言
Okara 是豆腐和豆奶生产的主要副产品，每年产生的量非常大且还在增加。传统的直接丢弃方式不仅会导致严重的环境污染，还会造成宝贵可再生资源的浪费，这对大豆加工业的环境可持续性和资源利用构成了紧迫的挑战（Tangkhawanit等，2022年）。Okara 是一种营养成分丰富的物质，含有15%～25%的蛋白质、3%～10%的脂肪和50%～70%的膳食纤维，使其成为高附加值产品的理想原料（Li等，2019年；Li等，2022年；Nile等，2020年）。因此，探索Okara的潜在功能成分并开发有效的利用策略对于实现经济和环境效益以及促进大豆加工业的可持续发展具有重要意义。
迄今为止，Okara的利用主要集中在将其作为乳液（Cai等，2021年）、水凝胶（Chen等，2020年）、油凝胶（Huang等，2023年）和肉味添加剂（Huang等，2023年）的原料，或者直接将其添加到饼干和面条等加工食品中（Lee, Gan, & Kim, 2020年）。尽管这些方法在一定程度上提高了Okara的价值，但其功能特性和营养成分尚未得到充分利用。发酵能有效改善Okara的感官品质和营养价值（Wei, Regenstein, & Zhou, 2021年），因为Okara中的高质量碳和氮源可以促进多种微生物的生长和发育（Cai等，2021年）。一些特定微生物，包括 乳酸菌、Rhizopus azygosporus、Bacillus subtilis 和 Bacillus natto（Wang等，2024年；Li等，2022年；Zhan等，2023年），已被证明是可以生产生物活性化合物的微生物工厂，这些化合物包括酯类、赤藓糖醇、纳豆激酶、α-淀粉酶、β-葡萄糖苷酶、多酚和异黄酮、膳食纤维、生物乙醇、肽类和多糖（Vong & Liu, 2018年；Liu等，2017年；Li等，2022年；Zhang等，2023年；Sun等，2020年；Liang等，2023年）。鉴于Okara中高蛋白质含量和丰富的碳/氮源，它成为微生物发酵生成生物活性肽的理想底物。
选择 Bacillus amyloliquefaciens YP2 作为发酵菌株，是因为其安全性和功能性潜力。作为一种在传统亚洲发酵食品中广泛使用的 GRAS（普遍认为安全的）微生物，它在食品应用中不会带来安全风险（Ji等，2026年）。我们的初步筛选也证实，用 B. amyloliquefaciens YP2 发酵的Okara 具有良好的ACE抑制活性。这些综合优势使其成为从Okara中生成生物活性肽的理想候选者。因此，迫切需要全面研究 B. amyloliquefaciens 发酵Okara 的生物活性。
据报道，发酵Okara产品具有多种生物活性，包括抗氧化、降血糖和抗菌特性，这些特性与发酵过程中产生的生物活性物质密切相关（Sitanggang等，2019年；Zhu等，2010年；Anjum等，2022年）。Dai等（2017年）通过固态发酵评估了 Bacillus subtilis 发酵的大豆粉的营养价值和生物活性，发现发酵产物具有很强的ACE抑制活性，尽管具体的生物活性化合物尚未被鉴定出来。肽 VPP 和 IPP 被报道为米酒酱中的潜在ACE抑制剂，表明发酵大豆制品富含具有调节血压潜力的生物活性肽（Inoue等，2009年）。除了ACE抑制作用外，Mami等还发现纳豆提取物对病毒感染具有抑制效果，并从用 Bacillus subtilis（KN2B 和 KN2M）发酵的大豆中鉴定出了抗病毒肽（Padhi等，2021年）。肽 DDFEDY、DEYEDY 和 DFVEDY 也被证实是对抗 SARS-CoV-2 的优秀候选物质，它们是非过敏性的、无毒的，并且具有良好的水溶性和对 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）的高亲和力（Liu等，2023年）。这些研究表明，在发酵大豆体系中可以发生ACE2的调节作用，因此在鉴定ACE抑制肽时应将其作为次要的选择性/安全性指标进行监测。尽管ACE仍然是抗高血压肽筛选的主要目标，但由于ACE和ACE2在肾素-血管紧张素系统（RAS）中具有相互调节作用，因此必须同时监测ACE2的抑制效果（Liao & Wu, 2021年）。此外，ACE2还是SARS-CoV-2的细胞进入受体，因此对其进行的初步特定背景评估对未来的抗病毒研究具有参考价值（Oh等，2023年）。由于具有强肾素抑制活性的食品来源肽相对较少（Pripp, 2007年），本研究未包含肾素这一关键RAS酶。
基于 B. amyloliquefaciens YP2 的安全性和功能性潜力，选择它作为发酵菌株。作为一种在传统亚洲发酵食品中广泛使用的GRAS微生物，它在食品应用中不会出现安全问题（Ji等，2026年）。我们的初步筛选也证实，用 B. amyloliquefaciens YP2 发酵的Okara 具有良好的ACE抑制活性。这些综合优势使其成为从Okara中生成生物活性肽的理想候选者。因此，迫切需要对 B. amyloliquefaciens 发酵Okara 的生物活性进行深入研究。
研究表明，发酵Okara产品具有多种生物活性，包括抗氧化、降血糖和抗菌作用，这些作用与发酵过程中产生的生物活性物质密切相关（Sitanggang等，2019年；Zhu等，2010年；Anjum等，2022年）。Dai等（2017年）评估了用 Bacillus subtilis 发酵的大豆粉的营养价值和生物活性，发现发酵产物具有很强的ACE抑制活性，尽管具体的生物活性化合物尚未被鉴定出来。肽 VPP 和 IPP 被报道为米酒酱中的潜在ACE抑制剂，表明发酵大豆制品富含具有调节血压潜力的生物活性肽（Inoue等，2009年）。除了ACE抑制作用外，Mami等还发现纳豆提取物对病毒感染具有抑制效果，并且从用 Bacillus subtilis（KN2B 和 KN2M）发酵的大豆中鉴定出了抗病毒肽（Padhi等，2021年）。肽 DDFEDY、DEYEDY 和 DFVEDY 也被证实是对抗 SARS-CoV-2 的优秀候选物质，它们是非过敏性的、无毒的，并且具有良好的水溶性和对 SARS-CoV-2 受体结合域（RBD）的高亲和力（Liu等，2023年）。这些研究表明，在发酵大豆体系中可以发生ACE2的调节作用，因此在鉴定ACE抑制肽时应将其作为次要的选择性/安全性指标进行监测。虽然ACE仍然是抗高血压肽筛选的主要目标，但由于ACE和ACE2在肾素-血管紧张素系统（RAS）中具有相互调节作用，因此必须同时监测ACE2的抑制效果（Liao & Wu, 2021年）。此外，ACE2还是SARS-CoV-2的细胞进入受体，对其进行的初步特定背景评估对未来的抗病毒研究具有参考价值（Oh等，2023年）。由于具有强肾素抑制活性的食品来源肽相对较少（Pripp, 2007年），因此本研究未包括肾素这个关键RAS酶。
在之前分离出 B. amyloliquefaciens YP2 的基础上，本研究采用 计算机模拟 和 体外 相结合的方法来利用Okara。本研究的目标是：(1) 从用 B. amyloliquefaciens YP2 发酵的Okara 中生成并分离肽库；(2) 通过 LC-MS/MS 分析结合生物信息学预测来鉴定和合成候选肽；(3) 体外验证它们的ACE抑制活性，并将 ACE2 的调节作用作为次要的选择性指标；(4) 通过分子对接阐明潜在的相互作用机制；(5) 通过 计算机模拟 预测水解位点及吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）特性来评估它们作为食品成分的潜力。通过结合多层次验证，包括 计算机模拟 分析，本研究旨在提供对Okara衍生肽的生物活性潜力和应用性的全面初步评估，为农业副产品的功能性食品开发提供新的见解。
章节摘要
化学物质和试剂
Okara 由中国中粮集团公司（北京）提供。Bacillus amyloliquefaciens YP2 来自中国传统发酵豆豉，并保存在中国科学院微生物研究所（CGMCC NO. 29157）。以下试剂和材料从商业供应商处购买：来自日本三菱的宏观孔吸附树脂 HP20；来自美国威斯康星州沃基肖的 GE Healthcare 的 Sephadex LH-20；以及来自 Duly 的 ACE 和 hippuryl-histidyl-leucine（HHL）。
发酵Okara提取物的功能和成分分析
使用 LC-MS/MS 分析了用 B. amyloliquefaciens YP2 发酵的Okara的代谢产物（图 1A）。共鉴定出属于17个类别的94种代表性化合物。其中，氨基酸及其衍生物最多（14.89%），其次是有机酸（11.70%）和萜类化合物（11.70%），这些是主要的化学成分。后续分析确认了其中含有大量的肽类成分，这从220纳米处的强紫外吸收峰可以得到验证
结论
总之，本研究建立了从 B. amyloliquefaciens YP2 发酵到多方面表征的完整流程，以实现对Okara的充分利用。五种新型肽（APGYSC、CKLLL、FPKYG、FPGPLV 和 FPRSH）被成功验证为ACE抑制剂，其中APGYSC的活性最强。ACE2的调节作用仅作为次要的选择性/安全性指标进行测量；因为ACE2的抑制可能会抵消ACE的抑制效果，因此不将其列为双重目标
CRediT 作者贡献声明
Nai-ru Ji： 起草——原始草稿、验证、方法学研究、数据分析、概念构建。Fei Ren： 验证、数据分析、数据处理。Jianni Zhao： 方法学研究、概念构建。Jiarong Yang： 概念构建。Yunping Zhu： 草稿撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集
未引用参考文献
Chamata等，2020年；Huang等，2023年；Ji等，2026年；Li等，2012年；Li等，2022年；Song等，2025年；Tangkhawanit和Siriamornpun，2022年；Wang和Gonzalez de Mejia，2005年；Ye等，2012年。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有可能影响本文研究工作的已知经济利益或个人关系。
致谢
本项目得到了中国国家自然科学基金的支持（项目编号32272253）。
Nairu Ji|Fei Ren|Jiani Zhao|Jiarong Yang|Yunping Zhu
