AAV8介导的CasRx在成年小鼠耳蜗及耳蜗核中的递送与表达研究

《Biochemistry and Biophysics Reports》：AAV8-mediated CasRx delivery and expression in the cochlea and cochlear nucleus of mice

　　

基于CRISPR/Cas9的基因组编辑技术近年来取得了显著进展，并已能够治疗多种遗传性疾病，包括先天性耳聋小鼠模型中的听力损失。然而，针对遗传性耳聋的基因编辑仍可能诱发基因组DNA的脱靶突变，这限制了其临床转化应用。CasRx，又称RfxCas13d，是一种结构紧凑的RNA靶向CRISPR效应蛋白，可被包装进腺相关病毒（AAV）载体中实现体内递送。CasRx是VI型CRISPR系统中新近鉴定出的一员，它通过调控靶标RNA的表达而不改变DNA序列，从而避免永久性脱靶突变，具有广泛的治疗潜力。本研究使用腺相关病毒血清型8（AAV8）将CasRx递送至C57BL/6J小鼠的耳蜗及耳蜗核（CN），并评估了其表达模式和短期安全性。病毒注射两周后，耳蜗核中神经元及其他细胞类型的数量和形态保持正常。重要的是，病毒递送后听觉脑干反应（ABR）阈值未发生改变，表明AAV8介导的CasRx表达在短期观察期内未对听觉功能造成可检测的损伤。综上所述，本研究证明了AAV8介导的CasRx在耳蜗和耳蜗核中递送与表达的可行性及短期安全性，为未来针对听觉疾病的引导RNA介导转录调控研究提供了递送平台。

一、研究背景与科学问题

据世界卫生组织统计，全球超过15亿人存在不同程度的听力损失，其中约4.3亿人需要康复服务，包括3400万儿童。感音神经性听力损失（SNHL）是最常见的类型，源于内耳、感觉上皮或听神经的病变。目前已发现超过100个与遗传性听力损失相关的基因位点，分子遗传学的进展极大增进了对耳聋病理生理机制及致病突变诊断的理解。然而，目前尚无针对遗传性非综合征型SNHL的有效药物疗法。多数SNHL患者虽可借助助听器或听觉植入物获得部分听觉功能，但仍存在言语识别能力差等局限。因此，亟需开发新型且更有效的治疗策略。

基因治疗在过去数十年发展迅速。基于AAV的基因疗法LUXTURNA?已获美国FDA批准用于RPE65突变相关视网膜营养不良，凸显了病毒基因递送在遗传病治疗中的前景。在听觉研究领域，多个团队已探索针对遗传性耳聋的病毒基因递送和基因组编辑方法。Gao等人将靶向Beethoven小鼠突变Tmc1等位基因的Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物在P0-2期递送，保护了后续听觉发育过程中的听觉功能，这是基因编辑治疗听力损失的首次成功应用。Xue等人使用AAV-PHP.eB载体在Myo6突变小鼠模型中递送SaCas9-KKH和sgRNA复合物，挽救了听力损伤的进展。

然而，CRISPR/Cas9介导的DNA编辑会永久性修饰基因组序列，正常基因组区域可能发生不可逆的脱靶突变，且许多载体缺乏细胞类型特异性，可能导致基因编辑机制在邻近细胞甚至远隔组织中广泛分布，引发非预期基因组改变。相比之下，RNA靶向策略通过调控转录本而不永久改变基因组DNA，提供了一种互补的治疗途径。CasRx（RfxCas13d）是一种结构紧凑的RNA靶向CRISPR效应蛋白，适合AAV载体包装递送。在听觉系统中，CRISPR/CasRx已在听力损失模型中初步探索：通过AAV–CasRx–gRNA递送敲低Htra2 mRNA可预防氨基糖苷类药物诱导的听力损失，且脱靶和全身副作用极小；Zheng等人使用AAV-PHP.eB在新生小鼠耳蜗中递送CasRx和sgRNA，成功改善了Tmc1^Bth小鼠的听力和毛细胞存活。

但部分遗传性耳聋主要由局限于内毛细胞（IHCs）的病变引起，而AAV8在成年小鼠IHCs中介导CasRx递送和表达的特性尚未被充分表征。此外，耳鸣与背侧耳蜗核（DCN）和腹侧耳蜗核（VCN）神经元的自发放电率（SFR）增加密切相关，针对耳蜗核（CN）的基因递送和表达研究此前未见报道。基于上述背景，研究人员开展了本研究。

二、研究目的与设计

本研究旨在使用AAV8载体（据报道可优先感染成年小鼠IHCs）将CasRx递送至耳蜗和耳蜗核，评估其表达模式和短期结构及听觉安全性。本研究不测试引导RNA介导的转录敲低或ADAR介导的RNA编辑，而是评估AAV8介导的CasRx递送和表达，作为未来引导RNA定向RNA调控研究的前提条件。

三、主要技术方法

研究人员构建了含CMV启动子、CasRx编码序列、Flag标签和EGFP报告基因的表达质粒，在HEK293T细胞中通过免疫荧光和Western blot验证了表达。随后将表达框包装进AAV8载体（AAV8-CMV-GFP和AAV8-CMV-CasRx-Flag-GFP，滴度分别为1.62×10^13和1.55×10^13 GCs/mL，由山东维真生物科技有限公司提供）。动物实验使用4-5周龄雄性C57BL/6J小鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司），每组至少3只。耳蜗注射通过后半规管（PSCC）通路进行，每耳注射1 μL（AAV8-CasRx为1.55×10^10 GC/耳）；耳蜗核注射通过部分吸除小脑暴露CN区域后直接注射，每只动物注射2 μL（3.10×10^10 GC/CN）。注射两周后，通过听觉脑干反应（ABR）检测听觉功能，通过免疫组织化学染色（抗MYO7A、抗Flag、抗NeuN）结合共聚焦显微镜评估表达模式和细胞形态。

四、研究结果

4.1 质粒构建与表达

研究人员合成了CasRx编码序列并克隆至CMV启动子控制下的哺乳动物表达载体中，Flag标签融合于CasRx C端，EGFP报告基因通过P2A自剪切肽连接以实现独立表达。质粒转染HEK293T细胞三天后，免疫荧光观察到强EGFP荧光，Western blot在约120 kDa处检测到CasRx–Flag的强表达，阳性对照产生较小的蛋白条带，阴性对照无Flag信号。这些数据证明质粒构建成功且CasRx在体外高效表达。

4.2 AAV8–GFP在成年小鼠内耳中的转导

基于既往研究显示AAV8可高效特异性感染成年小鼠IHCs，且CMV是内耳表达效率最高的启动子之一，研究人员选择AAV8-CMV-GFP经PSCC通路注射至4-8周龄野生型小鼠内耳。两周后免疫染色显示，GFP表达仅存在于IHCs中，外毛细胞（OHCs）为GFP阴性，证实AAV8对IHCs具有高度特异性。

4.3 CasRx在成年小鼠耳蜗中的表达

将AAV8-CasRx经PSCC注射至4周龄C57BL/6J小鼠内耳，两周后耳蜗铺片免疫染色显示IHCs中沿耳蜗各回均有强Flag表达，而OHCs为Flag阴性。顶回和中回近100%的IHCs表达Flag，底回每视野约25个IHCs中约10个为Flag阳性。与未处理对照组相比，AAV8-CasRx注射组IHCs和OHCs数量无明显差异，表明病毒注射未造成毛细胞丢失。

4.4 CasRx在成年小鼠耳蜗核中的表达

将AAV8-CMV-CasRx-Flag-GFP注射至4周龄C57BL/6J小鼠CN，两周后免疫染色显示DCN、后腹侧耳蜗核（PVCN）和前腹侧耳蜗核（AVCN）三个亚区中均有强Flag表达，分布于神经元和轴突中。高倍镜下部分NeuN阳性神经元显示Flag标记，表明神经元成功转导；DCN中许多DAPI阳性NeuN阴性细胞也表达CasRx，表明胶质细胞或其他非神经元细胞类型同样被转导。

4.5 AAV8介导的CasRx递送和表达不影响成年小鼠听觉阈值

注射AAV8-CMV-CasRx-Flag-GFP两周后进行ABR检测。耳蜗注射组在5.66、8、11.31、16、22.63和32 kHz的ABR阈值分别为38.3±2.9、28.3±2.9、15.0±5.0、20.0±5.0、25.0±0和46.7±5.8 dB SPL，与未注射组（37.5±2.9、25.0±0、16.3±4.8、17.5±5.0、21.3±4.8和38.8±4.8 dB SPL）和CN注射组（37.0±4.5、26.0±2.2、16.0±6.5、14.0±2.2、22.0±2.7和33.0±2.7 dB SPL）相当。80 dB SPL刺激下16 kHz的ABR波I振幅在未注射组为4.2±1.3 μV，耳蜗注射组为4.3±1.6 μV，CN注射组为3.8±0.6 μV，均无明显差异。结果表明AAV8介导的CasRx递送和表达在短期观察期内未对听觉功能造成不良影响。

五、讨论与结论

讨论部分总结

本研究构建了含CMV启动子、CasRx编码序列、Flag标签和EGFP报告基因的CasRx表达质粒，并在HEK293T细胞中验证了表达，随后包装进AAV8载体递送至成年小鼠耳蜗和CN。AAV8在内耳中特异性靶向IHCs，AAV8–CasRx在耳蜗和CN中均高效介导CasRx表达。注射两周后ABR阈值和波I振幅不变，表明CasRx表达不损伤耳蜗或CN功能。

与Anc80L65和AAV9–PHP.B等可感染多种耳蜗细胞类型的常用AAV血清型相比，AAV8对IHCs具有高度特异性，可降低非病变细胞中脱靶效应的风险。本研究中近全部IHCs被感染，与既往报道一致。观察到的分布模式是载体系统和递送途径的结果，而非CasRx本身的固有特性。底回IHCs转导效率相对较低（每视野约25个中约10个Flag阳性），可能在未来的治疗应用中适度降低底回毛细胞的RNA编辑效率。

与永久性DNA编辑相比，RNA靶向策略通过调控转录本而不改变基因组DNA，避免了永久性脱靶突变风险。本研究建立了AAV8介导CasRx在成年耳蜗和CN中递送和表达的平台，但未包含靶标特异性引导RNA或ADAR编辑模块，因此这些发现确立了递送和表达可行性，而非功能性RNA编辑。未来治疗应用中可能需要持续表达CasRx和引导RNA，因为靶标mRNA持续转录。本研究仅在AAV递送后两周评估了CasRx表达和听觉安全性，CasRx在IHCs和CN细胞中表达的持久性及引导RNA介导转录调控的持续时间仍有待确定。

在耳鸣研究方面，耳鸣动物模型DCN梭形细胞常表现为SFR增加，与KCNQ2/3通道活性降低和HCN通道活性改变相关。靶向DCN活性的药物策略目前缺乏FDA或EMA批准的药物。RNA靶向策略可能为操纵听觉回路中的疾病相关转录本提供未来途径。本研究中Flag标记在注射后两周遍布DCN和大部分VCN，存在于NeuN阳性神经元和DAPI阳性NeuN阴性细胞中，表明多种CN细胞群被转导，确立了AAV8介导CasRx在CN中递送和表达的可行性。

研究局限性：仅评估了CasRx表达的安全性，未在疾病模型中进行治疗干预；因缺乏CasRx特异性抗体，通过Flag标签间接推断CasRx表达；ABR采集和阈值判定未采用盲法；仅使用雄性小鼠，未评估性别依赖性差异。

研究结论

本研究数据表明，AAV8可高效介导CasRx在成年小鼠IHCs中表达，且AAV8-CasRx可递送至内耳和CN而不损害短期听觉功能。这些发现证明了AAV8介导的CasRx递送至听觉结构的可行性和短期安全性，为未来在耳聋、耳鸣及其他听觉障碍中应用引导RNA介导转录调控的研究提供了平台。