结直肠癌与胰腺癌诊断活检组织的RNA测序及蛋白质组学联合分析

《Biochemistry and Biophysics Reports》：RNA sequencing and proteomic analysis of diagnostic biopsies from colorectal and pancreatic cancer

　　

摘要 背景：结直肠癌（colorectal cancer, CRC）和胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是两种最常见且致命的癌症。尽管已有大量研究探讨了它们的转录组、分子和免疫学特征，但目前的认识仍不完整。这两种癌症均面临重大临床挑战，深入了解其分子和免疫学特征对于改善患者预后至关重要。 方法：研究人员对来自16例CRC和11例PDAC患者的29份诊断活检组织（涵盖原发肿瘤和转移灶）进行了总RNA测序和基于液相色谱-质谱（liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS）的蛋白质组学分析。由于组织量不足，PDAC原发肿瘤仅进行了蛋白质组学分析。数据分析包括RNA-蛋白质相关性分析、多维尺度分析（multidimensional scaling, MDS）、以热图结合无监督聚类呈现的样本间Pearson相关性分析、差异表达分析、基因本体（gene ontology, GO）富集分析，以及使用CIBERSORTx进行的免疫细胞反卷积分析。 结果：对所有可用活检组织的分析显示，RNA测序鉴定出46,492个表达转录本，蛋白质组学分析检测到6,973个蛋白质，其中5,563个基因在两个数据集中共有。RNA与蛋白质之间的平均绝对Spearman相关系数为0.241。在CRC中，探索性差异表达分析鉴定出5个转录本和99个蛋白质在转移灶与原发肿瘤之间存在差异表达。在PDAC中，转移灶与原发肿瘤的比较仅限于蛋白质组学分析，共鉴定出305个差异表达蛋白质。在基于样本间相关性的无监督聚类中，CRC和PDAC活检组织形成了两个独立的聚类。GO富集分析显示，与原发肿瘤相比，转移灶在分子功能、细胞组分和生物学过程方面呈现不同的上调和下调模式。推断的免疫细胞组分显示CD4记忆静息T细胞和M0巨噬细胞水平较高。 结论：这项探索性研究支持从有限的福尔马林固定石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）诊断活检组织中联合进行RNA测序和蛋白质组学分析的可行性，并强调蛋白质组学是转录组学的重要补充。这些发现增进了对生物学和免疫学异质性的理解，需要在更大的独立队列中进一步验证，以推动预后标志物和新型免疫治疗策略的未来开发。

结直肠癌与胰腺癌诊断活检组织的RNA测序及蛋白质组学联合分析：一篇论文解读

一、研究背景与科学问题

结直肠癌（CRC）和胰腺导管腺癌（PDAC）是两种最常见的胃肠道恶性肿瘤。PDAC是全球最致命的癌症之一，5年生存率不足10%，手术切除是唯一可能治愈的手段，但术后5年生存率仅约22%。大多数PDAC患者确诊时已处于晚期或不可切除状态，对化疗高度耐药，相对5年生存率仅约3%。CRC是全球第二大常见癌症，约20%的患者确诊时已发生转移，伴远处转移者的5年生存率约为13%。免疫治疗尤其是免疫检查点抑制剂（ICI）的疗效高度依赖肿瘤免疫微环境。微卫星不稳定（MSI-high）的CRC肿瘤通常被视为免疫"热"肿瘤，对ICI反应良好，而微卫星稳定（MSS）的CRC肿瘤则反应不佳；大多数PDAC肿瘤属于免疫"冷"肿瘤，对免疫治疗表现出耐药性。此外，实体瘤化疗面临药物摄取受限的重大挑战，PDAC因致密纤维增生性间质和血管化不良，药物递送尤为困难。既往研究已揭示肿瘤在转录组和蛋白质组水平上的异质性，但肿瘤分子和生物学特征的变异远未被完全理解，需要更多患者内和患者间的特征刻画以推动精准医学发展。基于此，研究人员对来自同一CRC或PDAC临床试验的患者诊断活检组织进行了RNA测序和蛋白质组学联合分析，旨在评估从有限FFPE活检组织中进行联合多组学分析的可行性，比较原发肿瘤与转移灶之间的RNA和蛋白质表达差异，并探索肿瘤的免疫景观。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员分析了来自16例CRC患者和12例PDAC患者的29份诊断活检组织，涵盖原发肿瘤和肝转移、十二指肠转移及卵巢转移等不同转移部位。所有样本均来自治疗初治肿瘤，仅一例CRC样本来自此前接受过放化疗的患者。由于组织量有限，PDAC原发肿瘤均未进行RNA测序，仅进行蛋白质组学分析。主要技术方法包括：对FFPE组织进行总RNA测序，使用DV200和RIN评估RNA质量；采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术进行蛋白质鉴定与定量，数据经MaxQuant处理；利用limma包进行差异表达分析，采用Benjamini-Hochberg方法校正P值；使用clusterProfiler进行基因本体（GO）富集分析；使用CIBERSORTx基于LM22特征矩阵进行免疫细胞反卷积分析；并利用癌症基因组图谱（TCGA）的结肠腺癌（COAD）和胰腺腺癌（PAAD）公开数据进行对比验证。

三、主要研究结果

RNA与蛋白质表达水平的比较：RNA测序鉴定出46,492个表达转录本，蛋白质组学检测到6,973个蛋白质，其中5,563个基因在两个数据集中共有。RNA与蛋白质之间的平均绝对Spearman相关系数为0.241，呈高斯分布，表明转录本与蛋白质表达之间存在中等程度的一致性。相关性最强的基因与线粒体功能、蛋白质降解和泛素通路、细胞外基质和免疫应答等相关。TCGA数据中平均转录本-蛋白质相关性为0.246，与本研究结果一致，但TCGA中相关性最强的基因与本研究无重叠，且TCGA蛋白质组数据基于反向蛋白阵列（RPPA）平台，与LC-MS方法存在方法学差异。

样本间总体RNA和蛋白质表达的比较：无监督聚类显示，无论是RNA还是蛋白质水平，CRC和PDAC活检组织均形成两个独立的主要聚类，表明两种癌症类型具有独特的RNA和蛋白质表达特征。RNA水平上，CRC肝转移灶与CRC原发肿瘤聚类在一起，而PDAC转移灶与所有CRC样本分离。蛋白质水平上，差异更为明显，CRC聚类清晰分离为转移灶和原发肿瘤两个亚群；PDAC转移灶未一致聚类，提示转移部位对肿瘤蛋白质表达的影响大于对RNA表达的影响。多维尺度分析（MDS）显示，蛋白质表达数据中第一维度捕获了28%的总方差，而RNA数据中仅捕获19%，进一步支持蛋白质表达受活检来源影响更大的观点。

转移灶与原发肿瘤的差异表达分析：在CRC中，RNA测序鉴定出5个差异表达转录本，其中VWF和HOXD3下调，RP1-60O19.1、CP和SERPINA3上调；蛋白质组学分析鉴定出99个差异表达蛋白质，其中42个下调、57个上调。在PDAC中，蛋白质组学分析鉴定出305个差异表达蛋白质，其中151个下调、154个上调。RPL10和RPA2编码的蛋白质在CRC和PDAC转移灶中均下调。与TCGA COAD数据的对比显示，虽然无单个显著差异表达基因重叠，但全基因组倍数变化呈中度正相关（Spearman's ρ = 0.35）。

GO富集分析：CRC转移灶中上调蛋白质与G蛋白活性和GDP结合相关，下调蛋白质与磷脂酰肌醇结合和核糖体结构相关；上调蛋白质与颗粒和血液微粒相关，下调蛋白质与核糖体相关；上调蛋白质与伤口愈合的负调控和血管生成相关。PDAC转移灶中上调蛋白质与肌动蛋白丝结合相关，下调蛋白质与核糖体、细胞骨架结构、GDP结合和单链DNA结合相关；上调蛋白质与收缩纤维、肌原纤维、粘附连接和肌动蛋白丝相关，下调蛋白质与核糖体组分相关；下调蛋白质与翻译、肌动蛋白丝调控、多种代谢过程和磷酸化相关。

免疫细胞反卷积分析：CIBERSORTx分析显示，大多数CRC活检组织具有高比例的CD4记忆静息T细胞，M0巨噬细胞在CRC原发肿瘤和CRC及PDAC肝转移灶中均存在。免疫细胞组分聚类未显示与患者总生存期的明确关联。来自既往接受治疗患者的样本（7_mCRC）在免疫细胞组分上与其他样本明显不同，其CD4记忆静息T细胞比例最高。

四、讨论与结论

研究人员将研究结果与TCGA公开数据进行了对比，发现RNA-蛋白质相关性水平相似，但TCGA中相关性最强的基因集中于高表达转录本和蛋白质，这可能反映了RPPA平台对高丰度蛋白质的偏好性捕获。TCGA COAD数据的MDS分析显示转移灶与原发肿瘤在转录组层面存在较大重叠，支持转移灶保留原发肿瘤大部分转录组特征的结论。差异表达分析中TCGA鉴定出远多于本研究的差异表达转录本，这主要归因于TCGA更大的样本量带来的更高统计功效。

研究人员指出，蛋白质组学数据中癌症类型聚类更明显，提示蛋白质组成比RNA组成更直接地捕获肿瘤特异性变异。CRC肝转移灶在RNA水平与原发肿瘤聚类，但在蛋白质水平与PDAC肝转移灶聚类，表明蛋白质表达受转移部位微环境影响更大。RNA与蛋白质相关性仅为中等水平，提示蛋白质丰度部分由转录后和翻译后调控机制决定，蛋白质组学可提供转录组学无法反映的补充生物学信息。GO分析揭示的肌动蛋白结合蛋白上调、核糖体蛋白下调、血管生成相关蛋白差异表达等特征，均与肿瘤转移机制密切相关，为理解转移过程提供了蛋白质组学层面的新线索。该研究为探索性研究，样本量有限，研究结果需要在更大规模的独立队列中验证，以推动预后标志物和新型免疫治疗策略的开发。