《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms》：Deletion of EZH2 increases oral epithelial cell stress responses
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增强子of zeste 2亚基（EZH2）是一种蛋白赖氨酸甲基转移酶，属于多梳抑制复合物2（PRC2），该复合物还包括SUZ12、EED及其他多种蛋白。该复合物催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3），这是一种抑制基因表达的表观遗传标记。研究人
增强子of zeste 2亚基（EZH2）是一种蛋白赖氨酸甲基转移酶，属于多梳抑制复合物2（PRC2），该复合物还包括SUZ12、EED及其他多种蛋白。该复合物催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3），这是一种抑制基因表达的表观遗传标记。研究人员利用转基因小鼠品系（KcEZH2），经他莫昔芬处理后可在口腔上皮干细胞（SCs）中敲除EZH2，以阐明EZH2缺失对正常舌上皮的影响。全基因组RNA测序（RNA-seq）分析显示，EZH2敲除（KO）后应激相关反应增强而细胞周期相关过程减弱。多种即刻早期基因（IEGs），如Egr1、Btg2、Fos和Junb，在KcEZH2-T组中显著上调。免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）证实EGR1、BTG2、c-Fos及c-Jun蛋白水平升高。Ki67免疫组化显示舌上皮基底干细胞增殖减少21.0%。染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR分析表明，在野生型（WT）小鼠舌上皮中，Egr1基因转录起始位点（TSS）下游约26 kb的远端沉默元件、Btg2启动子区域及Fos启动子和近端增强子附近的染色质存在H3K27me3修饰。此外，EZH2敲除后Loricrin和E-cadherin蛋白表达增加，提示分化增强，而Lor和Cdh1 mRNA水平未变，提示转录后调控。综上，研究人员证明EZH2缺失可刺激正常舌上皮的早期应激相关反应，瞬时抑制EZH2可能为口腔创面愈合提供创新策略框架。
研究背景：增强子of zeste 2亚基（EZH2）是蛋白赖氨酸甲基转移酶，为多梳抑制复合物2（PRC2）的催化亚基，催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3），该表观遗传标记与基因表达抑制相关。EZH2在表皮祖细胞中表达，其表达随胚胎分化和出生后增殖活性下降而降低，在干细胞（SCs）增殖和维持未分化状态中发挥作用。舌上皮由具有长期存活能力的干细胞组成的增殖性基底层维持，EZH2在人和小鼠舌上皮几乎所有基底干细胞中表达。既往研究表明EZH2在基底表皮干细胞中是皮肤稳态的重要调控因子，参与该组织创面愈合过程，提示EZH2在舌上皮中可能具有类似作用。此外，近期研究在其他组织和模型系统中发现EZH2在应激反应和创面愈合中具有关键作用：过表达EZH2可逆转体外人类成纤维细胞模型及老年小鼠肝脏中的细胞衰老标志；在体内皮肤模型中抑制EZH2可促进持续机械牵张诱导的应激后皮肤再生；在体内模型中抑制EZH2可加速心肌梗死后的心脏修复。由于导致舌部病变的多种疾病日益普遍，全面了解口腔创面修复机制的潜在关键调控因子十分必要。因此，了解EZH2在正常舌上皮稳态中的作用将为未来创新性口腔创面愈合方法研究奠定基础。研究人员此前已开发了转基因小鼠品系（KcEZH2），经他莫昔芬处理可在口腔上皮干细胞中敲除EZH2。本研究利用该模型阐明EZH2缺失对正常舌上皮的影响。
研究人员开展了什么研究及结论：研究人员利用KcEZH2转基因小鼠模型，经他莫昔芬诱导在舌上皮基底干细胞中特异性敲除EZH2，通过RNA-seq、免疫组化、免疫荧光、ChIP-qPCR等技术，系统分析了EZH2缺失对正常舌上皮的影响。结论表明，EZH2缺失可刺激正常舌上皮的早期应激相关反应，即使未对小鼠施加任何损伤；EZH2缺失增加Egr1、Btg2及AP-1复合物成员（如Fos）等应激相关反应基因的表达，这些基因的调控区域存在H3K27me3表观遗传修饰，提示EZH2通过经典PRC2介导的机制抑制这些基因表达；EZH2缺失还降低细胞周期相关通路和舌上皮基底干细胞增殖，并增加分化相关蛋白Loricrin和E-cadherin表达。重要意义在于，瞬时抑制EZH2可能为口腔创新性创面愈合方法提供理论框架。
关键技术方法：研究人员使用K14-CreERTAM; EZH2F/F（KcEZH2）转基因小鼠，6周龄雌性小鼠经他莫昔芬腹腔注射（4 mg/鼠/天，连续5天）诱导EZH2敲除，10周龄时采集样本；8–12周龄C57BL/6J野生型（WT）雄性小鼠（Jackson Lab）用于ChIP实验。主要技术方法包括：舌上皮组织RNA分离及实时/定量聚合酶链反应（q-PCR）；全基因组RNA测序（RNA-seq）及DESeq2差异表达分析和BioJupies富集分析；免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）及Fiji定量；两步染色质免疫沉淀（ChIP）结合q-PCR分析H3K27me3修饰。
研究结果：
3.1. EZH2蛋白在5天他莫昔芬处理后于KcEZH2小鼠舌上皮干细胞中被敲除：通过RT-qPCR检测Ezh2 mRNA不同区域及IF检测EZH2蛋白，发现他莫昔芬处理后含外显子16–17的Ezh2 mRNA显著降低（约32%），EZH2蛋白水平降低5.1倍（P=0.0003），约80%干细胞无EZH2染色，证实EZH2缺失的可诱导性和特异性。
3.2. EZH2敲除后舌上皮应激相关反应增加而细胞周期相关过程减少：RNA-seq分析显示45个转录本显著增加、47个显著减少；Egr1、Btg2、Fos、Junb等即刻早期基因（IEGs）显著上调，Mid1和Myo1b等细胞结构和迁移相关靶标下调；WikiPathways富集分析显示"Spinal Cord Injury"和"Photodynamic Therapy Induced AP 1 Survival Signaling"等通路显著上调，"Cell Cycle"通路显著下调；Reactome分析显示"Cohesin Loading Onto Chromatin"等细胞周期相关通路显著下调。
3.3. EZH2敲除增加舌上皮中应激反应相关蛋白表达：IHC显示EGR1蛋白升高4.6倍（P<0.0001），BTG2升高3.8倍（P<0.0001），c-Fos升高6.9倍（P<0.0001），c-Jun升高1.3倍（P=0.013），均在基底和基底上层细胞中检测到。
3.4. EZH2敲除后舌上皮干细胞增殖减少：IF显示EGR1在KcEZH2-T中升高8.1倍（P=0.0016），EZH2敲除细胞显示更高EGR1表达；Ki67 IHC显示KcEZH2-T组基底干细胞Ki67表达降低21.0%（P=0.0011）。
3.5. 小鼠舌上皮中Egr1、Btg2和Fos基因附近染色质存在H3K27me3表观修饰：确认EZH2缺失后H3K27me3全局降低约86%（P<0.0001）；ChIP-qPCR显示WT小鼠舌上皮中Egr1基因TSS下游约26 kb远端元件（P=0.019和P=0.013）、Btg2启动子区域（P=0.046）及Fos启动子和近端增强子（P=0.047和P=0.036）附近染色质存在H3K27me3修饰，提示PRC2介导的基因抑制。
3.6. EZH2敲除增加舌上皮Loricrin和E-cadherin蛋白表达：IF显示K14表达在基底干细胞中不变；Loricrin在KcEZH2-T上层细胞中升高2.1倍（P=0.024）；E-cadherin在基底上层升高3.9倍（P<0.0001）；Lor和Cdh1 mRNA水平未变，提示转录后调控。
讨论部分总结：研究人员利用KcEZH2转基因小鼠模型证明EZH2表达调控应激反应相关通路，所检测的IHC和IF因子均为参与创面修复和再生的即刻早期基因编码蛋白。这些应激相关反应可由缺氧、物理损伤、内质网应激、紫外线照射和机械应激等多种因素诱导。即刻早期基因是上皮细胞中ERK/MAPK通路激活和AP-1转录活性的标志性靶标，在组织再生中调控细胞增殖、迁移和结构重组。MAPK/AP-1激活是RNA-seq数据中最显著上调通路的关键组成部分。胆固醇生物合成通路也上调，膜胆固醇可调控细胞周期进程。EZH2缺失后即刻早期基因增加而Ki67降低，提示细胞周期进程暂停而非增殖爆发，与创面愈合早期阶段模式一致。Mid1和Myo1b下调及E-cadherin升高提示细胞迁移受抑。机制上，EZH2通过催化H3K27me3压缩邻近染色质结构阻止转录；研究人员确认EZH2缺失后H3K27me3全局降低，并证明即刻早期基因特定位点染色质存在该抑制性标记。Egr1 mRNA和EGR1蛋白升高，ChIP证实Egr1基因远端沉默元件附近存在H3K27me3标记，首次证明舌上皮中EZH2经典抑制Egr1表达。Btg2 mRNA和蛋白升高，ChIP证实Btg2启动子特定区域存在H3K27me3标记，首次证明口腔中EZH2经典抑制Btg2表达。Fos/c-Fos、Jun/c-Jun和Junb mRNA和/或蛋白升高，ChIP证实Fos启动子和近端增强子附近存在H3K27me3标记，首次证明口腔上皮中EZH2抑制Fos基因。EZH2缺失降低舌上皮干细胞增殖，RNA-seq下调通路为细胞周期调控主要组分；Btg2和Egr1可能介导EZH2对口腔上皮干细胞增殖的影响。EZH2缺失增加Loricrin和E-cadherin蛋白表达提示分化增强，与既往研究一致；Lor和Cdh1 mRNA未变提示转录后调控，需进一步功能研究确定这些分化效应是否为本研究鉴定的其他通路（如EZH2水平初始下降后的早期应激反应）的后果。
研究结论翻译：EZH2缺失增加舌上皮中参与应激相关反应的基因表达，包括Egr1、Btg2及AP-1复合物成员如Fos。这些基因的调控区域存在H3K27me3表观遗传修饰，提示EZH2通过经典PRC2介导的机制抑制其表达。这些转录因子和共调控因子转录本也是EZH2缺失后舌上皮中增加的生物学通路的关键组分。EZH2缺失还降低调控细胞增殖的细胞周期相关通路，并增加小鼠舌上皮中分化相关蛋白Loricrin和E-cadherin表达。总之，研究人员的数据表明EZH2缺失可刺激正常舌上皮的早期应激相关反应，即使未对小鼠施加任何损伤。由于创伤性损伤以及目前更为普遍的慢性疾病所致创面大幅增加，改进现有口腔创面修复方法正日益成为医学和社会优先事项。因此，瞬时抑制EZH2可能为口腔创新性创面愈合方法提供假设性框架。
