溶血磷脂酸20:4通过激活LPAR1是胆汁淤积相关瘙痒的关键致病因子

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease》：LPA 20:4 is a crucial factor in cholestasis-associated pruritus via activation of LPAR1

　　

胆汁淤积（cholestasis）被定义为胆汁形成和/或胆汁流受损，二者通常由肝细胞和胆管细胞生成。胆汁淤积患者表现出多种症状，如疲劳、瘙痒、腹痛或黄疸。与胆汁淤积相关的瘙痒（pruritus）存在于高达80%的原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis, PBC）患者中，PBC是最常见的慢性胆汁淤积性肝病，但因胆结石或恶性肿瘤导致的远端胆管梗阻患者报告瘙痒的频率要低得多。四肢通常受累，但也有全身性瘙痒的报道。瘙痒强度在一天中有所变化，最强烈的阶段出现在深夜和夜间凌晨，常导致睡眠剥夺。常规抗瘙痒治疗无效，近期应用的疗法如贝扎贝特、利福平和ASBT抑制剂也不能完全缓解瘙痒。胆汁淤积相关瘙痒对抗组胺药无反应，似乎只有在胆汁淤积缓解或肠肝循环（enterohepatic circulation, EHC）被中断时才能缓解。后一种治疗具有侵入性，因为需要手术分流或鼻胆管引流，并可能导致ERCP后胰腺炎等重大并发症。EHC中断的有效性是一个重要观察结果：最终导致瘙痒的级联反应中的启动因子似乎存在于EHC中。胆汁酸盐高效地通过EHC，并被认为可能是瘙痒因子。然而，研究人员观察到一组已知的瘙痒受体对胆汁酸盐反应不佳，质疑这些化合物的直接参与。NTCP缺陷个体无法将胆汁酸盐转运至肝细胞，这些患者循环胆汁酸盐水平高但不患瘙痒，进一步支持胆汁酸盐并非瘙痒受体的直接激动剂这一观点。尽管如此，研究人员和其他人通过证明大多数胆汁酸盐种类水平以及总胆汁酸盐水平与胆汁淤积相关瘙痒患者的瘙痒强度显著相关，提示胆汁酸盐在致痒级联反应中发挥间接作用。此外，在胆汁酸盐从肝细胞向胆汁输出特异性受阻的病理情况（尤其是ATP8B1、BSEP和BAAT缺陷）中观察到的瘙痒也支持胆汁酸盐在瘙痒中的间接作用。胆红素在胆汁淤积期间也在循环中积累，但极不可能在瘙痒中发挥致病作用，因为其升高与瘙痒强度不相关。事实上，在非瘙痒性高胆红素血症相关疾病中胆红素水平非常高，如Crigler-Najjar综合征患者，其中观察到非结合性高胆红素血症。研究人员过去已证明自分泌运动因子（autotaxin, ATX）可能在诱导瘙痒中发挥重要作用。该酶在肝细胞（以及其他细胞类型）中强表达，在多种疾病中升高。在胆汁淤积的背景下，血清自分泌运动因子的活性与患者的瘙痒强度相关。ATX介导溶血磷脂酰胆碱（lysophosphatidylcholine, LPC）水解为溶血磷脂酸（lysophosphatidic acid, LPA），后者已被证明是一种致痒物质。LPA种类是非常有效的信号分子，可激活LPA受体（LPA receptors, LPAR1–6），但也激活其他G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptors, GPCRs）如GPR87和P2Y10。然而，研究人员观察到缺乏12-OH基团的胆汁酸盐（如UDC、CDC及其结合物）抑制ATX活性，提示在胆汁淤积期间ATX活性可能降低。因此，LPA水平在患者中是否足够升高以引起瘙痒仍有待确定。某些LPAR在背根神经节（传入感觉神经元的胞体）中高表达。哪些LPAR负责人类瘙痒尚不清楚，但有报道称在小鼠背根神经节中，LPAR5抑制剂可降低对LPA响应的神经元活性。在小鼠中，局部注射LPA可诱导瘙痒，其中LPAR1似乎是负责的受体。值得注意的是，皮下预处理阿片拮抗剂纳洛酮可消除LPA注射的致痒效应，支持阿片受体在瘙痒反应中的 contributory 作用。胆汁淤积患者中升高的自分泌运动因子（ATX）水平是否产生足够的溶血磷脂酸（LPA）浓度以激活LPA受体（LPARs），以及这种受体激活在多大程度上贡献于瘙痒强度，仍有待确定。基于先前将增加的ATX活性与瘙痒联系起来的证据，本研究 specifically 旨在确定胆汁淤积患者中ATX驱动的LPA产生是否导致LPA–LPAR信号轴的功能性激活，以及这种激活是否与瘙痒严重程度相关。为此，研究人员量化了胆汁淤积患者血浆样本中的ATX活性、各LPA种类以及LPAR1–6的激活状态，同时测定溶血磷脂酰胆碱（LPC）水平，并将这些生化标志物与验证过的瘙痒视觉模拟量表（visual analog scale, VAS）评分进行相关性分析。此外，研究人员分析了胆汁淤积患者肝活检的公开RNA测序数据集，以确定ENPP2（ATX）表达增加的潜在肝脏来源。

**研究背景**：胆汁淤积相关瘙痒是慢性胆汁淤积性肝病（尤其是原发性胆汁性胆管炎，PBC）患者中常见的严重症状，严重影响生活质量。现有常规抗瘙痒治疗（如贝扎贝特、利福平、ASBT抑制剂）疗效有限，且瘙痒的分子机制尚未完全阐明。既往研究表明自分泌运动因子（ATX）活性与瘙痒强度相关，ATX催化溶血磷脂酰胆碱（LPC）水解生成溶血磷脂酸（LPA），LPA可激活LPA受体（LPAR1–6）。然而，胆汁淤积患者中ATX驱动的LPA产生是否足以功能性激活LPAR并贡献于瘙痒严重程度尚不明确。此外，胆汁酸盐是否直接致痒存在争议，NTCP缺陷患者高胆汁酸盐水平但不出现瘙痒，提示胆汁酸盐可能通过间接机制参与。因此，研究人员旨在探究ATX-LPA-LPAR信号轴在胆汁淤积相关瘙痒中的作用，并确定具体的LPA种类和受体亚型。

**主要技术方法**：研究人员收集了成人健康对照和肝胆胆汁淤积性疾病患者（PSC、PBC、PFIC、LPAC及梗阻性胆汁淤积）的外周静脉血样本，采用EDTA血浆和血清进行检测。主要技术方法包括：利用PRESTO-Tango系统（基于β-arrestin招募和TEV蛋白酶切割释放tTA转录因子激活荧光素酶报告基因）检测LPAR1、LPAR2、LPAR4、LPAR5和LPAR6的激活；采用Indo-1荧光法测定细胞内游离Ca²⁺动员以评估LPAR3激活；使用uHPLC-MS/MS定量血浆胆汁酸盐、LPA和LPC种类；通过酶法测定ATX活性；采用Meso Scale Discovery电化学发光法量化细胞因子（IL-6、IL-8、CXCL10、TNFα）；利用qPCR检测Hep3B细胞中ENPP2 mRNA表达；并分析公开肝活检转录组数据集（GSE159676）。

**研究结果**：

**3.1 胆汁淤积相关瘙痒患者的临床和生化特征**：研究人员收集了44例主要为肝内胆汁淤积患者（PSC 16例、PBC 12例、PFIC2/3 4例、SSC 10例）的血浆和血清样本，按VAS评分（0–100）分为无至轻度瘙痒组（VAS≤30）和中至重度瘙痒组（VAS>30）。两组间女性比例和年龄无差异，总胆红素、γGT和ALT无差异，但中至重度瘙痒组的碱性磷酸酶（AP，p=0.045）和AST（p=0.0289）水平较高。

**3.2 患者血浆对LPAR亚型的激活**：利用PRESTO-Tango系统检测发现，中至重度瘙痒患者血浆显著激活LPAR1（p<0.0001），且该激活可被ATX抑制剂ziritaxestat几乎完全消除（p<0.0001），证明患者血浆中的ATX活性是LPAR1激活所必需的。LPAR4在中至重度瘙痒组也被显著激活（p=0.0008）。LPAR2和LPAR5无显著激活。LPAR6仅被无至轻度瘙痒患者血浆激活（p=0.0152）。采用钙动员实验检测LPAR3，发现中至重度瘙痒患者血浆诱导的LPAR3激活显著高于健康对照。

**3.3 患者血浆中ATX活性**：瘙痒患者血浆ATX活性升高（p=0.0409），且与瘙痒强度显著相关（Spearman r=0.37，p=0.0242）。按有无肝脏炎症分层后，ATX与瘙痒严重程度的相关性仅见于有肝脏炎症的患者（Spearman r=0.58，p=0.0026）。ATX活性与AST（r=0.4978，p=0.0020）及几乎所有结合型胆汁酸盐种类和总胆汁酸盐水平（r=0.5773，p=0.0001）显著相关，但与胆红素、γGT和AP无关。

**3.4 胆汁淤积中ATX的肝脏表达和调控**：分析公开肝活检转录组数据集（GSE159676）发现，胆汁淤积患者肝脏ENPP2（ATX）表达上调（p=0.0127）。血浆TNFα在中至重度瘙痒患者中升高（p=0.0313），IL-6在两组患者中均升高，IL-8和CXCL10在中至重度瘙痒组升高。体外实验表明TNFα（25 ng/ml）显著诱导Hep3B细胞ENPP2 mRNA表达（p=0.0019），而FXR激动剂CDC（15 μM）未能可重复地诱导ENPP2表达。

**3.4.1 患者和健康对照中LPA和LPC水平及其与瘙痒评分和临床生化参数的相关性**：与既往报道相反，LPC 18:0、18:1、18:2和20:4水平在中至重度瘙痒患者中显著降低而非升高。KEGG通路分析显示胆汁淤积患者肝脏PLA2G4A和LPCAT2表达增加且与ENPP2表达相关，提示Lands循环增强导致LPC降低。LPA检测显示，LPA 16:0在患者中升高、LPA 18:0降低，但均不与瘙痒强度相关。LPA 18:1和18:2在中至重度瘙痒组升高且与ATX活性相关，但不与VAS评分相关。LPA 20:4在中至重度瘙痒组显著升高（p=0.0005），是该组中最丰富的LPA种类，且是唯一与瘙痒强度评分显著相关的LPA种类（Spearman r=0.3852，p=0.0069），也与血浆ATX活性显著相关（r=0.49，p=0.0017）。LPA 18:1、18:2和20:4均与多项血清肝功能指标及LPAR1激活显著相关，其中LPA 20:4与LPAR1激活的相关性最强（r=0.60，p=0.0003）。

**讨论部分总结**：研究人员讨论了胆汁酸盐在瘙痒中的间接作用，指出胆汁淤积小鼠模型常不出现瘙痒，限制了机制研究。研究数据表明LPA 20:4和LPAR1是胆汁淤积相关瘙痒的关键因子，LPA 20:4是唯一与患者报告的瘙痒强度显著相关的LPA种类。LPAR1和LPAR2偏好不饱和LPA，与实验观察一致。LPAR3对中至重度瘙痒患者血浆的激活显著高于对照，但差异不如LPAR1和LPAR4明显。LPAR6仅被无至轻度瘙痒患者血浆激活，且与循环LPA种类无相关性，提示LPAR6信号可能依赖ATX–LPAR6微结构域。研究人员承认结论基于人类关联数据和离体受体激活实验，尚不能提供体内因果关系的 definitive 证据。有肝脏炎症的患者中LPA 20:4、ATX活性、LPAR1激活与瘙痒的主要关联更为显著，提示肝脏炎症在胆汁淤积相关瘙痒发生中可能发挥重要作用。ATX抑制剂ziritaxestat几乎完全消除血浆诱导的LPAR1激活，表明受体激活依赖于ATX持续将LPC水解为LPA，而非血浆LPA的瞬时浓度。LPC水平降低可能与Lands循环活性上调有关。体外实验显示TNFα诱导Hep3B细胞ENPP2表达，而CDC未能可重复诱导，质疑FXR激动在ATX诱导中的主要作用。

**研究结论翻译**：总之，研究人员的发现为自分泌运动因子衍生的溶血磷脂酸（LPA）种类在胆汁淤积相关瘙痒病理生理学中的作用提供了实质性证据。数据表明，ATX-LPA-LPAR通路的激活，特别是通过与LPAR1的相互作用， contributory 于瘙痒感觉，其中LPA 20:4成为该过程中的重要介质。这些结果与现有关于LPA作为强效致痒物质的文献一致，并支持胆汁淤积相关瘙痒由特定LPA种类和LPA-受体相互作用驱动的假说。进一步聚焦于LPAR诱导的瘙痒，特别是靶向LPAR1（和LPAR4）的研究，可能为胆汁淤积性疾病中瘙痒的治疗提供新的治疗途径。