《Journal of Clinical Microbiology》：Accuracy of plasma cell-free DNA PCR versus mNGS for non-invasive diagnosis of invasive mold disease
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血浆中游离DNA（cfDNA）检测是免疫功能低下患者侵袭性霉菌病（IMD）无创诊断的一种新型检测手段。PCR与宏基因组二代测序（mNGS）诊断IMD的准确性比较尚不清楚。研究人员采用霉菌PCR和鸟枪法mNGS对确诊和临床诊断IMD以及无IMD患者的血浆样本进行
血浆中游离DNA（cfDNA）检测是免疫功能低下患者侵袭性霉菌病（IMD）无创诊断的一种新型检测手段。PCR与宏基因组二代测序（mNGS）诊断IMD的准确性比较尚不清楚。研究人员采用霉菌PCR和鸟枪法mNGS对确诊和临床诊断IMD以及无IMD患者的血浆样本进行检测。霉菌PCR可检测曲霉属（Aspergillus species）、毛霉目病原体（Mucorales agents）、镰刀菌属（Fusarium species）、足放线菌属（Scedosporium species）和罗蒙孢子菌（Lomentospora prolificans）。研究人员测定了霉菌PCR和mNGS的灵敏度和特异度。本研究纳入94例由曲霉属（64例）、毛霉目病原体（13例）、足放线菌属和罗蒙孢子菌（13例）及镰刀菌属（6例）所致的确诊（48例）和临床诊断（48例）IMD患者，以及62例无IMD患者。99.4%（155例）的患者存在免疫抑制。霉菌PCR的总体灵敏度和特异度分别为62.5%（60/96；95% CI 52.0–72.2）和99.8%（535/536；95% CI 99.0–100）；mNGS的总体灵敏度和特异度分别为43.8%（42/96；95% CI 33.6–54.3；P < 0.001）和99.6%（534/536；95% CI 98.7–100；P = 1.0）。在局灶性病例中，霉菌PCR阳性/mNGS阴性结果的比例为16.0%（4/25），多灶性病例为25.0%（11/44；P = 0.384），播散性病例为18.5%（5/27；P = 0.810）。PCR阳性/mNGS阴性病例的中位PCR循环阈值为40.6（IQR，37.5–41.5），而PCR阳性/mNGS阳性病例为37.3（IQR，34.5–39.3；P = 0.004）。血浆cfDNA PCR诊断免疫功能低下患者IMD的灵敏度高于mNGS。mNGS灵敏度较低与霉菌cfDNA载量较低相关。
研究背景：侵袭性霉菌病（IMD）是免疫功能低下患者发病和死亡的主要原因，尤其多见于血液系统恶性肿瘤、造血干细胞移植（HSCT）和实体器官移植（SOT）患者。早期诊断并启动针对性抗真菌治疗可改善预后。然而，不同病原体所致IMD的临床和影像学表现缺乏特异性，实验室诊断对个体化管理至关重要。传统真菌诊断方法如微生物培养和组织病理学检查存在明显局限：真菌培养灵敏度低，组织病理学缺乏特异性，二者均耗时且需侵入性活检，对病情不稳定患者可能不可行。非侵入性血清真菌生物标志物如曲霉半乳甘露聚糖和β-D-葡聚糖的灵敏度和特异度欠佳，难以满足临床需要。近年来，检测血浆和血清中循环真菌DNA短片段即游离DNA（cfDNA）成为IMD早期无创诊断的新型检测手段。血流中存在的真菌DNA片段来源于深部感染灶，使无法接受支气管镜和手术活检的不稳定患者得以无创检测。目前临床实验室检测霉菌cfDNA主要采用两种分析方法：PCR和鸟枪法宏基因组二代测序（mNGS）。PCR简便、快速、相对廉价，已在众多临床实验室用于IMD常规检测；mNGS耗时、昂贵、高度复杂，目前仅少数参考实验室提供。尽管IMD的准确诊断在免疫功能低下患者中具有重要临床意义，但PCR与mNGS诊断IMD的相对准确性尚知之甚少。既往研究报道曲霉和毛霉目cfDNA PCR具有中等至较高灵敏度，mNGS具有中等灵敏度，但尚无在同一队列中直接比较两种方法准确性的头对头研究。了解两种方法的相对准确性对选择合适方法诊断和管理高危免疫功能低下患者的IMD具有重要意义。本研究旨在直接比较血浆cfDNA PCR与mNGS诊断IMD的准确性。
研究人员开展了一项回顾性诊断准确性研究，直接比较霉菌血浆cfDNA PCR与mNGS在IMD患者中的准确性。研究对象包括2022年1月至2025年10月因临床诊疗前瞻性接受霉菌血浆cfDNA PCR检测且 panel 中任一靶标阳性并留有残余cfDNA提取物的疑似IMD患者；以及同期PCR panel阴性但按欧洲癌症研究与治疗组织及真菌研究组教育与研究联盟（EORTC/MSGERC）临床诊断IMD定义具有宿主因素的患者，按约2:1（IMD:无IMD）比例随机选取纳入。此外，2015年1月至2025年10月按EORTC/MSGERC定义确诊或临床诊断IMD、未接受霉菌血浆cfDNA PCR检测或检测阴性但存有冻存血浆样本的患者也被纳入并回顾性接受PCR和/或mNGS检测。本研究仅纳入mNGS的霉菌结果，排除非霉菌结果。以EORTC/MSGERC定义的确诊和临床诊断IMD作为真实感染参考标准，无IMD作为无霉菌感染参考标准。主要终点为比较霉菌血浆cfDNA PCR与mNGS的灵敏度和特异度。研究共纳入156例独特患者的156份血浆样本，包括130份前瞻性样本和26份回顾性样本。患者中位年龄59岁（IQR，44–68），53.8%（84/156）为男性。99.4%（155/156）患者因血液系统恶性肿瘤（47.4%）、实体器官移植（25.6%）、实体器官恶性肿瘤（11.5%）、造血干细胞移植（7.7%）及其他原因（7.1%）存在免疫抑制。临床表现局灶性占32.1%，多灶性占49.4%，播散性占18.6%。按EORTC/MSGERC定义，确诊48例（30.4%）、临床诊断48例（30.4%）、无IMD 62例（39.2%）。在临床诊断病例中，微生物学证据依据为呼吸道培养阳性30例（62.5%）、血清半乳甘露聚糖阳性17例（35.4%）、连续呼吸道PCR阳性1例（2.1%）。确诊或临床诊断IMD病例的病原霉菌为曲霉属64例、毛霉目病原体13例、足放线菌属和罗蒙孢子菌13例、镰刀菌属6例。两例患者存在双重感染。采集血浆行霉菌PCR和mNGS检测时，63.5%（99/156）的全部患者和65.6%（63/96）的确诊及临床诊断IMD患者正在接受霉菌活性抗真菌治疗。
关键技术方法概述（不超过250字）：本研究采用回顾性诊断准确性设计，纳入前瞻性临床检测队列及冻存血浆样本队列（Stanford Health Care，2022年1月至2025年10月前瞻性；2015年1月至2025年10月回顾性）。霉菌血浆cfDNA PCR为实验室自建检测，采用Maxwell RSC仪及ccfDNA血浆试剂盒提取2–4 mL血浆，在Rotor-Gene Q 5plex实时PCR仪上对曲霉属、毛霉目、足放线菌属/罗蒙孢子菌行单重PCR，对土曲霉、焦曲霉/构巢曲霉及镰刀菌属行多重PCR，以人β-珠蛋白基因作内参。mNGS采用KAPA EvoPrep建库，Illumina NextSeq 500/550单端150循环测序，FASTQ文件上传Chan Zuckerberg ID（CZ ID）平台进行分类学分析，以RPM比值判定阳性。采用受试者工作特征曲线Youden最大指数确定mNGS cutoff。对PCR阴性/mNGS阳性病例行计算机模拟引物探针比对分析。
研究结果：（1）患者特征：共纳入156份血浆样本，确诊和临床诊断IMD各48例，无IMD 62例，病原以曲霉属为主（64例），绝大多数患者存在免疫抑制。（2）霉菌PCR与mNGS的准确性：mNGS每份血浆样本中位 reads 数为31,972,952，平均质量评分Q30，基于Youden最大指数确定mNGS cutoff为RPM比值≥0.1，两种检测均获100%确定性结果。确诊或临床诊断IMD患者中，霉菌PCR总体灵敏度为62.5%，显著高于mNGS的43.8%（P < 0.001）。接受霉菌活性预防患者中，PCR和mNGS灵敏度分别为62.5%和45.3%（P = 0.007）。曲霉属PCR和mNGS灵敏度分别为60.9%和46.9%（P = 0.022），毛霉目分别为100%和61.5%（P = 0.063）。确诊和临床诊断病例中，PCR与mNGS灵敏度分别为64.6%和45.8%（P = 0.022）及60.4%和41.7%（P = 0.004）。该组中PCR阳性/mNGS阳性40例，PCR阳性/mNGS阴性20例，PCR阴性/mNGS阳性2例，双阴性34例。霉菌PCR和mNGS总体特异度分别为99.8%和99.6%（P = 1.0）。（3）不一致结果分析：2例确诊IMD为PCR阴性/mNGS阳性，经靶向泛真菌核糖体RNA扩增测序分别鉴定为烟曲霉复合群和曲霉属，mNGS鉴定为Aspergillus glaucus和Aspergillus thermomutatus，计算机模拟分析显示霉菌PCR正向引物存在显著错配，改良引物后A. glaucus病例PCR转阳。PCR阳性/mNGS阴性病例的霉菌活性预防率与PCR阳性/mNGS阳性病例无显著差异（65.0% vs 67.5%，P = 0.835）。两种检测在多灶性和播散性疾病中阳性率均高于局灶性疾病，但PCR阳性/mNGS阴性结果的比例在局灶性与多灶性、播散性疾病间无显著差异。PCR阳性/mNGS阴性病例中位循环阈值为40.6，显著高于PCR阳性/mNGS阳性病例的37.3（P = 0.004），提示mNGS灵敏度较低由循环霉菌cfDNA载量低所致。
讨论部分总结：早期诊断并启动有效抗真菌治疗对优化免疫功能低下IMD患者预后至关重要。血浆和血清循环真菌cfDNA检测是日益用于IMD早期诊断的新型无创手段，PCR和mNGS均被临床实验室采用，但尚无头对头研究比较二者相对准确性。本研究直接比较了靶向IMD主要病原的霉菌PCR与mNGS检测霉菌cfDNA的诊断准确性，发现霉菌cfDNA PCR灵敏度显著高于mNGS，二者特异度均极高；在侵袭性曲霉病、毛霉病和足放线菌病亚组中趋势相似，但仅曲霉病差异有统计学意义，可能因样本量较小。该结果与既往非头对头研究一致，提示PCR较mNGS更敏感，对检测方法选择具有启示：临床怀疑IMD时PCR应优先作为一线检测，但PCR不能检测 panel 未覆盖的罕见霉菌，mNGS可作为灵敏度较低的非靶向互补方法用于PCR阴性但高度怀疑IMD的病例。本研究2例确诊IMD为PCR阴性/mNGS阳性，计算机模拟分析证实PCR正向引物错配导致假阴性，说明mNGS的互补作用。PCR灵敏度较高部分源于核酸扩增可检测含靶标的稀疏cfDNA片段，而mNGS非偏倚测序仅覆盖样本中一小部分cfDNA片段，绝大部分来源于宿主。PCR阳性/mNGS阴性病例中位循环阈值显著较高，提示mNGS灵敏度较低由血浆霉菌cfDNA浓度低于mNGS检测限但仍可被PCR检出所致，疾病范围与mNGS假阴性无关。本研究设计力求公平评估，纳入前瞻性连续PCR阳性病例及随机选取的宿主因素/PCR阴性患者，并纳入PCR阴性或未行PCR的确诊/临床诊断患者，可能使曲霉cfDNA PCR灵敏度低于本机构既往报道。尽管PCR灵敏度较高，mNGS参数设置偏向最大化其灵敏度：每样本中位 reads 数约3200万，超过推荐2000万；RPM比值cutoff源自同一评估队列，可能高估mNGS准确性；cutoff≥0.1旨在最大化灵敏度，而其他研究采用更高RPM比值（>5）以避免环境及试剂污染。本研究局限性包括：单中心、几乎全部为免疫功能低下患者，结果可能不适用于其他中心；临床诊断病例中部分可能并无IMD，可能低估灵敏度且对mNGS影响更大，但确诊与临床诊断病例的PCR和mNGS总体灵敏度无显著差异，且仅限确诊案例时霉菌PCR较高灵敏度仍维持；毛霉目、足放线菌属/罗蒙孢子菌和镰刀菌属病例数少，需更大研究；对照为随机选取的PCR阴性宿主因素患者，可能遗漏PCR阴性/mNGS阳性病例而低估mNGS灵敏度，但除2例PCR panel未覆盖的曲霉外，mNGS遗漏了大量PCR检出病例且未额外检出病例，故研究设计不太可能显著影响mNGS灵敏度评估；结果仅适用于本研究所评估的霉菌PCR和mNGS检测，可能不适用于其他PCR检测及采用不同测序平台、深度和生物信息流程的mNGS；除前瞻性PCR检测血浆样本的冻存残余cfDNA提取物用于mNGS外，两种检测的预分析样本处理和cfDNA提取完全相同，既往研究显示冻融提取DNA不影响DNA质量与数量；本研究未评估Karius报道的无提取“in-matrix”血浆mNGS流程，未来需研究其相对PCR的灵敏度改善程度。
研究结论翻译：总之，本研究表明，采用血浆进行IMD无创诊断时，霉菌cfDNA PCR灵敏度显著高于mNGS，二者均具有高特异度。mNGS的性能差距似乎由循环真菌cfDNA载量低所致。研究结果对临床实践中IMD无创诊断的检测方法选择具有启示，支持将PCR作为疑似IMD患者的首选一线方法。
