《Genes》：Findings Spectrum from Comprehensive CFTR Gene Sequencing in Reproductive and Clinical Settings: A Retrospective Analysis of 834 Consecutive Cases
编辑推荐：
背景：通过下一代测序（NGS）进行的全面CFTR基因分析能够检测广谱的CFTR变异，包括与囊性纤维化（CF）、CFTR相关疾病（CFTR-RD）相关的变异以及意义不明的变异（VUS）。然而，描述全面CFTR测序在南欧人群中实际应用的数据仍然有限。方法：本回顾性
背景：通过下一代测序（NGS）进行的全面CFTR基因分析能够检测广谱的CFTR变异，包括与囊性纤维化（CF）、CFTR相关疾病（CFTR-RD）相关的变异以及意义不明的变异（VUS）。然而，描述全面CFTR测序在南欧人群中实际应用的数据仍然有限。方法：本回顾性研究纳入2018年至2024年间在希腊两家诊断分子遗传学实验室接受全面CFTR基因测序的834例连续个体。该队列包括32例产前样本和802例产后样本，因各种临床和生殖指征送检。变异解读基于CFTR特异性数据库、已发表证据及实验室评估。结果：在834例个体中，141例（16.9%）检出CFTR发现。36例（4.3%）检出致CF变异，42例（5.0%）检出CFTR-RD相关变异，50例（6.0%）检出VUS。13例（1.6%）携带两种不同的CFTR变异，作为独立的互斥类别进行分析。常规携带者筛查是最常见的送检指征（67.9%），其次为体外受精/生殖规划（15.7%）。结论：本研究描述了在接受生殖和临床检测的希腊队列中通过全面测序所识别的CFTR发现谱。研究结果突显了常规实践中遇到的CFTR变异的多样性，以及谨慎进行变异解读和遗传咨询的重要性。
**研究背景**
囊性纤维化（CF）是全球最常见的限制生命的常染色体隐性遗传病之一，在欧洲血统人群中约每2500–3500例活产中发生1例，携带者频率约为1/25–1/30。CF由位于染色体7q31.2的囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因致病变异引起。CFTR基因跨度约230 kb，包含27个外显子，编码一种受cAMP调节的氯离子和碳酸氢根通道，在上皮离子转运中发挥核心作用。迄今已描述超过2000种CFTR序列变异，但仅一部分被确证与经典型CF或CFTR相关疾病（CFTR-RD）相关，许多其他变异仍被归类为良性或意义不明的变异（VUS）。在希腊，既往分子研究数量有限，但已证明CFTR基因突变谱高度异质，除常见的p.Phe508del（F508del）突变外还识别出众多罕见变异，突显了希腊人群相当大的遗传多样性。这种显著的等位基因异质性，加之可变外显率、复杂等位基因以及许多变异不完全的基因型-表型相关性，使CFTR成为常规分子诊断和遗传咨询中最具挑战性的基因之一。
下一代测序（NGS）的引入扩大了CFTR分子诊断的范围，使其能够分析比预定义突变组合更广泛的变异。传统突变组合在检测常见致病变异方面仍然快速且经济有效，但其覆盖范围仅限于每个组合所包含的变异，且其性能可能因CFTR变异谱不同的人群而异。全面CFTR测序有助于识别可能未包含在靶向组合中的罕见、人群特异性和非经典型变异。然而，每种检测方法的相对优势取决于临床指征、受检人群和检测范围。全面CFTR分析在诊断和生殖场景中应用日益增多，其中更广泛的变异检测可能支持临床评估和遗传咨询。
全面CFTR测序可识别广谱变异，包括经典型CF致病变异、CFTR-RD相关变异、低外显等位基因、复杂等位基因和VUS，其临床意义可能差异显著。这些发现的解读需要整合多种证据来源，包括人群频率、功能研究、共分离数据、表型相关性以及 curated 疾病特异性资源，如CFTR临床与功能翻译（CFTR2）数据库和病童医院（SickKids）维护的CFTR数据库。因此，分子发现应在临床表现、家族史和现有支持证据的背景下解读，遗传咨询在传达不确定性和指导临床决策方面发挥重要作用。这些考量突显了需要真实世界数据集来描述不同送检指征下识别的CFTR变异谱及其解读相关挑战。
尽管全面CFTR测序已被广泛采用，但其在常规临床实践中的实施仍存在若干重要知识空白。大多数已发表研究主要关注分析性能、变异频率或选定患者人群，而相对较少研究描述了不同送检指征下CFTR发现的谱和频率，或探讨日益复杂的检出变异谱的临床意义。此外，尽管近期国际建议倡导全面和泛族裔的CFTR检测策略，但描述这些策略如何影响日常诊断实验室中变异解读和遗传咨询的证据仍然有限，尤其是在具有相当等位基因异质性的南欧人群中。这些观察强调需要大型真实世界队列研究，以描述送检指征下CFTR发现的谱和频率，并考察临床解读和患者咨询相关的实际挑战。
在本研究中，研究人员报告了在希腊两家分子遗传学实验室分析的834例连续产前和产后病例中进行全面CFTR基因测序的六年经验，这是迄今为止通过全CFTR测序评估的最大希腊队列。除描述所识别CFTR变异的谱和频率外，研究人员还试图描述不同临床送检指征下CFTR发现的分布特征，并评估其对常规临床实践中变异解读和遗传咨询的意义。通过提供来自地中海人群的真实世界数据，研究结果旨在为支持全面CFTR测序在诊断和生殖场景中临床实施的日益增长的证据体系做出贡献。
**关键技术方法**
本研究为回顾性观察性研究，纳入2018年6月至2024年9月在希腊塞萨洛尼基两家诊断分子遗传学实验室（DNA-Diagnosis N Analysis和Microgenome）接受全面CFTR基因分析的834例连续个体，包括802例产后样本和32例产前样本。全面CFTR基因分析采用下一代测序（NGS），覆盖基因整个编码区、所有外显子-内含子边界（±20 bp）以及两个非翻译区（5′和3′ UTR）。靶向富集使用Devyser CFTR CE-IVD检测（Devyser AB，斯德哥尔摩，瑞典），随后在Illumina MiSeq平台（Illumina，圣迭戈，CA，美国）上测序。测序数据使用Sophia DDM?平台（Sophia Genetics，洛桑，瑞士）分析，序列比对和变异检出以参考转录本NM_000492为基准。变异命名遵循人类基因组变异学会（HGVS）建议，变异解读采用美国医学遗传学与基因组学学会/分子病理学协会（ACMG/AMP）框架，并结合CFTR2数据库、SickKids CFTR数据库、ClinVar及人群频率数据。统计分析中分类变量以数字和百分比表示，送检指征与CFTR发现类别之间的总体关联采用基于Pearson卡方统计量的条件精确检验的蒙特卡洛近似（500,000次模拟列联表，固定边际总数）进行评估，适用时计算比值比（OR）及95%置信区间（95% CI），双侧p值<0.05认为具有统计学意义。
**研究结果**
**队列特征与送检指征**：研究期间共834例个体接受全面CFTR基因分析，包括32例产前和802例产后样本。最常见的送检指征为常规筛查（566/834，67.9%），其次为体外受精/生殖规划（131/834，15.7%）、家族史（59/834，7.1%）、不孕症（45/834，5.4%）、超声发现（30/834，3.6%）以及不孕症合并家族史的联合指征（3/834，0.4%）。送检指征在产前和产后样本间差异显著。在产后队列中，常规筛查是最常见指征（557/802，69.5%），其次为体外受精/生殖规划（131/802，16.3%）。相比之下，产前队列以超声发现为主，占20/32例（62.5%），而常规筛查占9/32例（28.1%）。家族史在两组中均为不常见指征，分别占3例产前和56例产后送检。
**全面CFTR测序的总体发现**：全面CFTR基因测序在141/834例个体（16.9%）中识别出CFTR发现，而693例（83.1%）无临床相关发现。36例（4.3%）检出致CF变异，42例（5.0%）检出CFTR-RD相关变异，50例（6.0%）检出VUS。此外，13例（1.6%）携带两种不同的CFTR变异，作为独立的互斥类别进行分析。这些发现揭示了通过全面测序识别的CFTR变异的广谱性，包括与经典型囊性纤维化、CFTR相关疾病相关的变异以及临床意义仍不确定的变异。最常识别的变异为c.1521_1523delCTT（p.Phe508del），在27例个体（3.2%）中检出，其次为c.2620-15C>G在12例（1.4%）和c.2991G>C（p.Leu997Phe）在11例（1.3%）中检出。补充表S1共纳入74种不同的CFTR变异，反映了全面CFTR测序所检测到的广谱序列变异。
**CFTR发现按送检指征的分布**：基于条件精确检验的蒙特卡洛近似，CFTR发现类别的分布在送检指征间无显著差异（p = 0.111）。CFTR-RD相关变异在566例常规筛查个体中检出28例（4.9%），在131例体外受精/生殖规划送检个体中检出8例（6.1%），在45例不孕症检查个体中检出1例（2.2%）。经典型致CF变异在30例因产前超声发现送检的个体中检出4例（13.3%），相比之下在131例体外受精/生殖规划送检个体中检出3例（2.3%），在59例因囊性纤维化家族史送检个体中检出2例（3.4%）。靶向统计分析表明，因产前超声发现送检的个体携带经典型致CF变异的 odds 高于因其他指征送检的个体（OR = 3.71，95% CI：1.22–11.27；双侧Fisher精确检验，p = 0.036）。该关联应谨慎解读，因为超声组中仅4例个体携带致CF变异。相比之下，尽管在体外受精/生殖规划组和家族史组中分别观察到较高比例的CFTR-RD变异和VUS，但这些差异未达到统计学显著性。携带两种不同CFTR变异的13例个体分布于多个送检类别中，尤其是常规筛查、囊性纤维化家族史和不孕症检查个体。这13例个体的变异组合、各变异分类及送检指征已总结；变异相位未确定，现有数据不足以进行明确的基因型-表型解读。
**讨论与结论**
本研究描述了希腊834例因生殖和临床指征送检的连续个体中通过全面CFTR基因测序识别的CFTR发现谱。研究结果显示，检测不仅识别出致CF变异，还识别出CFTR-RD相关变异和VUS，突显了常规诊断实践中CFTR分析的解释复杂性。这一广谱发现对实验室实践、变异解读和遗传咨询具有重要意义，尤其是在具有相当等位基因异质性的人群中。
本研究的主要发现之一是，全面CFTR测序的临床价值不仅在于改善经典型致病变异的检测。虽然靶向突变组合在识别特定人群中最常见的致病等位基因方面仍然有效，但其固有地受限于预定义的变异内容，可能无法检测罕见、人群特异性或临床相关的非经典型变异。在本队列中，CFTR-RD变异和VUS合计占临床相关发现的大多数，强调全面测序的主要优势不仅在于提高分析灵敏度，还在于其捕获完整临床显著CFTR变异谱的能力。这些发现与既往基于测序的携带者筛查研究报告识别广谱CFTR变异的结果一致。然而，本研究未直接比较全面测序与传统靶向突变组合，因此无法确定这些方法的相对诊断性能。此外，这些发现与当前倡导全面测序策略的国际建议一致，尤其是在族裔多样人群以及需要准确变异表征以进行诊断、生殖咨询和个性化患者管理的临床场景中。
本研究的一个重要发现是识别出CFTR-RD相关变异（n = 42）和VUS（n = 50），二者合计占通过全面测序识别的CFTR发现的相当比例。这些发现说明了基于测序的CFTR检测扩展所伴随的主要挑战之一：分析灵敏度的提高伴随着对疾病贡献可能不确定、依赖背景或被其等位基因背景和临床表型修饰的变异的检出。此外，变异分类不一定是静态的，因为额外的人群、共分离、临床、RNA和功能证据可能随时间改变对个体CFTR变异的解读。因此，分子遗传学实验室的作用已从序列检测扩展到整合性变异解读，需要评估基因型、表型、家族史、人群频率、功能证据、相位和CFTR特异性 curated 资源。这对于CFTR-RD变异和VUS尤为重要，因为仅凭分子发现可能不足以确立诊断或预测临床结局。因此，多学科评估和专业遗传咨询对于传达不确定性、指导适当的表型或家系调查以及在 new evidence 可用时促进定期重新评估和患者再联系至关重要。
本队列中识别出74种不同的CFTR变异进一步说明了常规分子检测中遇到的广泛等位基因异质性。尽管c.1521_1523delCTT（p.Phe508del）是最常检出的变异，但其仅占所有变异出现的一小部分，而大多数其余变异仅观察到一次或在少数个体中观察到。这一模式与既往研究一致，表明地中海和南欧人群表现出比许多北欧人群更广泛和更异质的CFTR变异谱，后者中较少数量的复发性致病等位基因占CF病例的较大比例。近期来自意大利中南部队列的基于NGS的数据同样显示了CFTR变异的广泛分布，包括众多罕见和不确定的发现，强化了预定义突变组合在遗传异质人群中捕获完整分子谱的能力有限。综上所述，这些发现强调全面CFTR测序在遗传异质人群（如希腊人群）中尤其有价值，其广泛等位基因谱远远超出传统筛查组合所包含的相对少数变异。
本研究的另一个值得注意的观察是，CFTR发现类别的分布在送检指征间无显著差异。总体比较未达到统计学显著性（p = 0.111），尽管该结果应在某些送检类别样本量较小的背景下解读。这些发现描述了常规实践中遇到的生殖和临床指征范围内CFTR发现的分布，但未确立不同送检组间识别特定发现类别可能性的差异。这一观察与从基于指征和族裔的检测向扩展和泛族裔携带者筛查策略的渐进转变一致，后者倡导无论祖先背景或初始送检原因如何都进行全面的分子检测。尽管经典型致CF变异在因胎儿超声异常送检的妊娠中比例较高，但鉴于本队列纳入的产前病例数量有限，该发现应谨慎解读。同样，在不孕症和生殖规划送检中观察到的CFTR-RD变异频率的适度差异未达到统计学显著性，因此在更大队列确认之前应谨慎解读。
本研究具有若干重要优势。据研究人员所知，这是通过全面CFTR测序评估的最大希腊队列，涵盖生殖和临床送检指征，提供了常规诊断实践中遇到的分子谱的真实世界概览。连续纳入送检个体最大限度地减少了选择偏倚，反映了常规分子诊断实践中遇到的病例多样性。此外，全面CFTR测序的使用结合根据当前ACMG建议和疾病特异性CFTR分类系统的标准化变异解读，使得能够详细表征经典型和非经典型CFTR变异。然而，应承认若干局限性。队列来自塞萨洛尼基两家诊断实验室，其变异分布可能不能完全代表整个希腊人群。此外，并非所有携带CFTR-RD变异或VUS的个体均可获得共分离分析、功能研究和长期临床随访，妨碍了进一步评估变异致病性和基因型-表型相关性。此外，本回顾性分析未评估poly-T/TG tract，拷贝数变异未通过正交方法系统确认，预期测序覆盖范围之外的深层内含子变异可能被遗漏。未来整合分子、功能和纵向临床数据的多中心研究对于进一步细化罕见CFTR变异的解读和改善其临床分类将具有重要意义。
总体而言，研究结果反映了CFTR分子诊断不断演变的格局，其主要挑战已不再局限于检测致病变异，而日益在于其准确的临床解读。随着全面测序融入常规生殖和诊断实践，罕见CFTR变异、CFTR-RD等位基因和VUS的识别将继续增加，强调需要标准化的疾病特异性解读框架、专家多学科评估以及疾病特异性变异数据库（如CFTR2）的持续更新。在此背景下，全面CFTR测序应被视为一种识别广谱CFTR变异的方法，同时认识到个体发现的临床意义可能仍不确定。只要结果结合现有临床信息和基因检测的局限性进行解读，该方法可支持基于证据的临床决策和个性化遗传咨询。
**结论**：全面CFTR测序在生殖和临床送检指征中识别出广谱CFTR发现，包括致CF变异、CFTR-RD相关变异和VUS。该希腊队列中观察到的显著等位基因异质性突显了在常规临床实践中表征广谱CFTR变异的价值，尤其是在遗传异质人群中。随着可检测CFTR变异谱的持续扩展，准确的变异解读、多学科协作和适当的遗传咨询对于最大化分子检测的临床价值将日益重要。
