结直肠癌中氧化应激-微小RNA-雌激素受体β调控轴的双向互作与分子机制

《Genes》：Oxidative Stress–MicroRNA Interactions in Colorectal Cancer and Their Possible Relationships with Estrogen Receptor β

　　

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的发病机制以氧化还原稳态（redox homeostasis）、表观遗传调控（epigenetic regulation）及激素依赖性信号通路（hormone-dependent signaling pathways）的显著改变为特征。氧化应激（Oxidative Stress, OS）可促进DNA损伤（DNA damage）、基因组不稳定性（genomic instability）、慢性炎症（chronic inflammation）及多条信号通路的激活。此外，多种微小RNA（microRNAs, miRs）的失调可增加增殖（proliferation）、侵袭（invasion）、转移（metastasis）、上皮-间充质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）及血管生成（angiogenesis），并促进细胞凋亡（apoptosis）与治疗抵抗（resistance to therapy）。日益增多的数据表明，活性氧（reactive oxygen species, ROS）与miRs之间存在双向相互作用（two-way interaction），即OS可影响miRs的表达，同时miRs亦可影响细胞内氧化还原状态（intracellular redox state）。这种相互关系在CRC的启动（initiation）、发展（development）及治疗应答（response to treatment）中发挥作用。雌激素受体β（Estrogen Receptor β, ERβ）是CRC发展过程中的防御要素之一，其在结直肠癌发生（colorectal cancerogenesis）过程中表达逐渐降低；相反，其激活可抑制炎症（inflammation）、增殖（proliferation）、迁移（migration）、侵袭（invasion）及血管生成（angiogenesis），并增强细胞凋亡（apoptosis）与DNA修复（DNA repair）。此外，ERβ能够调控多种与CRC相关的miRs表达，并参与细胞内氧化还原状态（intracellular redox state）的调节。有限的且往往为间接的数据表明，miRs与OS在调控ERβ表达及反之亦然的环节中发挥作用。然而，破坏涉及OS、miRNAs与ERβ的复杂调控网络（complex regulatory network）可能促进CRC的发展，而恢复该网络则可能代表一种有前景的治疗策略（therapeutic strategy）。

CRC是男性第三大及女性第二大常见癌症，也是全球癌症相关死亡的主要原因之一。CRC通常由腺瘤性息肉经多因素过程发展而来，受遗传、表观遗传、代谢及环境因素共同影响。危险因素包括年龄、吸烟、久坐、饮酒、肥胖、高脂低纤维饮食、肠道微生物群及慢性炎症性肠病（IBD）等，以及家族性腺瘤性息肉病（FAP）和遗传性非息肉病性结直肠癌（HNPCC）等遗传因素。代谢改变涉及Krebs循环、核苷酸合成、糖酵解及氨基酸、脂质和固醇代谢。有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和Wnt/β-catenin信号通路的激活参与CRC发病。CRC在男性中更常见，年轻女性生存率更高，绝经后未使用激素替代疗法（HRT）的女性风险更高，提示17β-雌二醇（17β-E2）通过结肠组织主导的雌激素受体β（ERβ）发挥保护作用。ERβ具有抗增殖、抗炎及促凋亡特性；ERα在正常结肠黏膜低表达，在CRC中上调并激活Wnt/β-catenin通路促进转移。G蛋白偶联雌激素受体（GPER）作用情境依赖。ERβ通过抑制Wnt/β-catenin、上调Bax、抑制NF-κB及调节抗氧化酶发挥保护效应。微小RNA（miRs）是18-25个核苷酸的单链非编码RNA，在转录后水平调控基因表达。miRs失调和氧化应激（OS）是CRC主要促进因素。ROS与miRs存在双向交互：miRs调控氧化还原状态，OS改变miRs表达。ERβ可通过增加抗氧化防御降低OS，并促进凋亡；但高水平ROS亦可改变ERβ构象与表达。ERβ可直接（结合雌激素反应元件（EREs））或间接（抑制Myc或表观遗传机制）上调特定miRs；反之miRs可调控ERα和ERβ（ESR1/ESR2）。miR-22-5p/TET2轴是间接表观遗传调控的例子。本文旨在综述OS、miRs及ERβ在CRC中的分子机制及相互联系。

Oxidative Stress and CRC

生理条件下，ROS作为正常代谢产物，其水平受抗氧化系统调控以维持氧化还原稳态，并参与NF-κB、MAPKs、PI3K/Akt、Nrf2、Keap1、AREs、TLR4及STAT3等通路。肠道生理性氧化还原状态调控Wnt/β-catenin和Notch等增殖和分化相关通路。当ROS过量且抗氧化系统无法抵消时，OS发生，导致细胞损伤、代谢紊乱及信号通路改变，诱发癌症和治疗抵抗。OS在肿瘤发生与细胞死亡间具双重作用，可通过线粒体和内质网应激诱导铁死亡（Ferroptosis）。CRC中慢性OS主要由线粒体功能障碍和NADPH氧化酶（NOXs）上调引起，导致ROS增加、DNA损伤、突变和染色体不稳定。OS可改变miRs的表达、生物发生、稳定性及功能，机制包括激活NF-κB和HIF-1α等转录因子、调控DGCR8和Dicer等蛋白表达，以及诱导DNA甲基化、组蛋白乙酰化和磷酸化等表观遗传改变。慢性炎症性肠病（IBD）相关的慢性炎症显著促进CRC发展。OS标志物显示CRC患者GSH、GPX和CAT降低，GSSG和SOD升高；NOX1、COX-2和TNFα水平升高；8-氧-2'-脱氧-7,8-二氢鸟苷（8-oxodG）等DNA氧化产物升高提示ROS增加。4-羟基壬烯醛（4-HNE）可引起DNA交联和突变，激活非经典Hedgehog（HH）通路、COX-2、Nrf2和HO-1表达。

Nrf2 Signaling Pathways

OS下Nrf2与Keap1解离并入核，与AREs结合诱导抗氧化基因转录。Nrf2在早期保护正常结肠细胞，但持续激活在CRC后期促进癌细胞存活和凋亡抵抗。Nrf2/Keap1和Nrf2/ARE通路激活与化疗抵抗相关。线粒体ROS激活Nrf2影响糖酵解、氧化磷酸化、线粒体生物发生和线粒体自噬。ADSL在CRC中过表达，促进OS和Nrf2/Keap1通路激活。FOXA2过表达与Nrf2/GPX4（铁死亡抑制因子）激活正相关；抑制FOXA2可诱导铁死亡。OS激活Nrf2促进HO-1表达，核HO-1与CRC进展和转移相关，通过促进侵袭、血管生成、减少凋亡和铁死亡参与；但HO-1亦有抗瘤作用。PERK/Nrf2/HO-1通路激活可导致铁死亡，伴随GSH降低和脂质过氧化增加。

Wnt/β-Catenin Signaling Pathway

OS上调Wnt/β-catenin通路，通过下游靶点、肿瘤微环境和癌症干细胞促进CRC。APC功能降低与通路共同激活，APC通过降解β-catenin抑制增殖。中等OS下β-catenin和APC在原发性CRC细胞中增加而在转移细胞中降低。JNK抑制可使β-catenin和APC恢复对照值（仅原发性细胞）。外源性H₂O₂增加β-catenin和LGR5表达，但LGR5过表达与JNK激活相关。SLC7A11在CRC中升高并与分期和转移相关。DDT代谢物通过激活NADPH氧化酶、降低GSH和SOD/CAT活性增加ROS，激活Wnt/β-catenin和Hedgehog/Gli1通路。OS激活Wnt/β-catenin导致的增殖增加可由STAT3激活介导。Sirt1在CRC中响应OS而过表达，通过去乙酰化β-catenin和p53参与进展、迁移和增殖。

PI3K/Akt and NF-κB Signaling Pathways

PI3K/Akt通路激活促进CRC增殖和侵袭、减少凋亡。ROS通过抑制PTEN激活PI3K；反之PI3K/Akt增加ROS。COX-2由ROS诱导，通过下调PTEN和激活PI3K/Akt促进增殖侵袭、抑制凋亡。NF-κB受OS激活在炎症相关CRC中重要，可被TLR4、MAPK、STAT和PI3K等通路激活，发挥抗凋亡作用。CRC患者组织中NF-κB激活与MMP9增加同时发生。OS激活MMPs，MMP2和MMP9在CRC患者血清中升高，参与细胞外基质（ECM）降解。

miRs and CRC

miRs通过与靶mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）互补结合导致降解或翻译抑制。miRs作为致癌基因或肿瘤抑制因子取决于靶基因。多种miRs表达改变有助于诊断、预后和治疗。

Principal miRs Upregulated in CRC and Their Role

miR-21通过抑制SMAD7、PDCD4和PTEN促进PI3K/Akt通路激活、增殖、侵袭和EMT。miR-223下调PRDM1、BCL2L11等促进增殖侵袭，减少凋亡。miR-31抑制TIAM1，激活RAS、MEK5/ERK5和HIF-1α通路，降低5-FU敏感性但增加放射敏感性。miR-155靶向SOCS1、PTPRJ和PTEN，激活JAK2/STAT3和NF-κB/p65；增加claudin-1、β-catenin，下调E-cadherin，上调ZEB1，激活Wnt/β-catenin，促进EMT；但亦有研究显示其抑制增殖、诱导凋亡。miR-135b靶向APC、TGFβR2、DAPK1等，减少USP13导致PTEN降解，激活PI3K/Akt；增加顺铂和Oxa抵抗。miR-27a-3p减少BTG1、CACNA2D3等，抑制凋亡、促进增殖侵袭，激活Wnt/β-catenin。miR-17-92簇靶向PTEN、BCL2L11等，受Wnt/β-catenin正反馈调控，促进血管生成和5-FU抵抗。

Principal miRs Downregulated in CRC and Their Role

miR-143/145簇下调与肿瘤启动相关，增加IGF1R、KLF5等表达；低miR-143与KRAS高表达相关，激活MAPK/ERK1/2。miR-34家族下调上调INHBB、AXL等，促进迁移侵袭、自噬和EMT。miR-126下调激活RhoA、Akt和ERK1/2，EGFL7高甲基化导致其沉默，增加VEGF。miR-138下调与TWIST2、Sirt1负相关，激活NFIB/Snail 1和SP1/LGR5，增加PDK1导致Oxa抵抗。miR-133a/b下调与晚期分期相关；miR-133a减少增加RFFL表达，抑制p53，增加UBA2等，降低化疗敏感性；miR-133b上调DOT1L，维持干细胞特性，导致5-FU和Oxa抵抗。miR-497缺失上调KSR1、IGF1R等，激活ERK1/2和PI3K/Akt，促进EMT。let-7家族下调与侵袭性相关，部分成员下调通过IGF通路促进进展。

Interplay Between miRs and OS in CRC

miRs与ROS双向关系：miRs调控ROS产生和Nrf2/Keap1、SOD/过氧化氢酶通路；ROS通过激活NF-κB和HIF-1α、调控DGCR8和Dicer、诱导表观遗传改变影响miRs。OS促进miR基因启动子高甲基化导致沉默。CAC中miR-222-3p高水平与OS和炎症相关，下调BRG1并抑制Nrf2/HO-1；抑制miR-222-3p激活BRG1/Nrf2/HO-1，减轻UC损伤。HCT116细胞miR-186等模拟物处理诱导衰老，增加ROS和p21^Cip1/WAF1。miR-210过表达增加ROS，诱导G2/M阻滞和凋亡；抑制ROS可阻断该凋亡。缺氧增加miR-210，减少ISCU和COX10表达，增加糖酵解抑制剂敏感性。miR-27a-3p与CACNA2D3降低相关，减少ROS。miR-20a敲低增加顺铂敏感性，涉及ROS和JNK。miR-124、miR-1和miR-133b诱导OS促进凋亡。miR-143下调SOD1、PRDX2等增加Oxa敏感性。miR-22-3p增加ROS诱导凋亡。miR-1225-5p激活Keap1/Nrf2/HO-1减少ROS。miR-369-3p下调增加TGF4，提高LDH和MDA。miR-138-5p下调增加MCU和线粒体ROS。miR-212减少MnSOD；miR-128增加ROS促进TRAIL凋亡。剪切应力诱导miR-335-5p等变化，这些miRs与羟基自由基负相关。亚油酸诱导线粒体OS上调miR-494。姜黄素诱导ROS减少miR-27a、miR-20a等。H₂O₂调控miR-138与HIF1α的相互作用，长链非编码RNA RP11-431M3.1在不同OS水平下隔离miR-138。抗氧化剂阻断miR-21上调。

Protective Role of ER-β in CRC

ERβ维持上皮结构和免疫反应，其缺失与肠通透性增加、结肠炎和CRC风险相关。正常组织ERβ占主导，CRC中ERα/ERβ比值增加。ERβ抑制CAC中TNFα和NF-κB通路，调节肠道微生物群。17β-E2通过ERβ减少DNA损伤，刺激ERβ表达。ERβ与ERE结合调控细胞黏附、凋亡和Wnt信号。其抗肿瘤机制包括促进DNA修复、抑制癌基因、抑制周期蛋白D1（促进降解）、抑制mTOR或激活BNIP3诱导自噬、上调p21（CDKN1A）、抑制Wnt/β-catenin、上调p53和Bax等促凋亡基因、减少c-Myb和Bcl-2、通过p38 MAPK激活caspase-3、减少uPA、tPA、MMP-2和MMP-9。ERβ下调PDGFA和ANGPTL4，抑制HIF通路。双酚A作为拮抗剂促进CRC；植物雌激素（如染料木素、槲皮素）通过ERβ发挥抗癌作用。黄芪甲苷抑制IGF-1R和miR-95，激活凋亡。

Relationship Between ERβ and Oxidative Stress

ERβ减少诱导炎症促进OS；ERβ抑制NF-κB和PI3K/AKT。ERβ在其他器官中可能具抗氧化作用。在TCam-2细胞中ERβ介导ROS产生，在HCT8 ERβ过表达细胞中不影响ROS。DLD-1细胞中17β-E2通过ERβ诱导NGB表达，保护细胞但逆转雌激素促凋亡作用。Fagonia cretica提取物减少DNMT1和ROS，增加ERβ。OS作为表观遗传不稳定驱动因素，可能间接抑制ERβ表达，但尚未在CRC中证实。

Relationship Between ERβ and miRs

ERβ与miRs形成调控环路。ERβ上调改变27种miRs表达（miR-205和miR-10a/b上调，其余下调），部分受Myc调控。ERβ通过Myc下调抑制miR-17-92簇，增加CLU和NCOA3，增强凋亡。ERβ减少miR-200a/b，降低SW480细胞迁移。ERβ下调miR-196a-1增加膜联蛋白1，抑制NF-κB。17β-E2通过ERβ下调miR-135b、miR-31和miR-155，ICI 182,780可逆转。柚皮素发酵提取物在双酚A存在下仍增加ERβ，减少miR-200c和miR-141，增加PTEN。黄芪甲苷诱导ERβ，抑制PI3K/Akt，下调IGF-1R和miR-95；在HCT116中减少miR-17。miR-129在CRC中高表达，下调ERβ表达，是ERβ的靶标。

Conclusions and Future Perspectives

OS、miRs和ERβ参与CRC发病。OS具双重作用；miRs失调促进肿瘤发生，特定miRs有诊断预后价值；ERβ主要发挥保护性作用，抑制增殖、侵袭和血管生成，促进DNA修复和凋亡。三者作为复杂调控网络发挥作用：ROS调控miRs，miRs调控氧化还原通路，ERβ调控炎症和肿瘤信号。ERβ可能通过限制炎症和OS维持氧化还原稳态，其缺失促进促氧化环境。ERβ抑制NF-κB和PI3K/AKT，调控多种miRs（如miR-129上调直接结合ESR2的3'UTR抑制ERβ），形成双向环路。未来研究应在同一CRC模型中验证该调控轴，确定联合靶向的治疗优势。