《Genes》：Pan-Cancer Analysis and Functional Validation Reveal a Role for MAN1A1 in Promoting Metastasis-Associated Phenotypes in Triple-Negative Breast Cancer
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背景/目的：三阴性乳腺癌（TNBC）侵袭性强且易发生远处转移。MAN1A1编码一种参与N-糖链加工的高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶，但其泛癌特征及在TNBC转移中的作用尚不清楚。方法：研究人员整合癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）、人类蛋
背景/目的：三阴性乳腺癌（TNBC）侵袭性强且易发生远处转移。MAN1A1编码一种参与N-糖链加工的高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶，但其泛癌特征及在TNBC转移中的作用尚不清楚。方法：研究人员整合癌症基因组图谱（TCGA）、基因型-组织表达（GTEx）、人类蛋白质图谱（HPA）和基因表达综合数据库（GEO）数据，刻画MAN1A1在各癌种中的表达、临床结局、Hallmark通路及免疫特征，并进一步聚焦乳腺癌与TNBC进行分析。功能效应通过LM2细胞中MAN1A1敲低、MDA-MB-231细胞中过表达、Transwell实验及裸鼠尾静脉注射模型进行评估。整合LM2 RNA测序（RNA-seq）、实时定量PCR（qPCR）验证以及TCGA-TNBC转录组与免疫微环境分析，探究MAN1A1相关分子特征。结果：MAN1A1在表达、预后关联及分子改变方面呈现显著的癌种异质性。其在TNBC中并未特异性高表达；然而在乳腺癌及TNBC中较高的MAN1A1表达与较差的总生存及转移相关特征相关。MAN1A1敲低抑制LM2细胞迁移、侵袭及实验性肺转移，而过表达增强MDA-MB-231细胞迁移与侵袭。LM2 RNA-seq揭示与上皮-间质转化、细胞黏附、细胞外基质重塑及炎症相关的转录程序发生改变。TCGA-TNBC显示一致的转录模式及独特的免疫与基质微环境特征。结论：MAN1A1促进TNBC细胞迁移、侵袭及实验性肺转移，并伴随细胞黏附、细胞外基质（ECM）重塑、迁移及炎症相关转录程序的改变。这些发现支持MAN1A1作为TNBC中情境依赖的转移相关分子，并为进一步探究其潜在分子机制提供了基础。
研究背景：乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，远处转移是影响长期生存的主要决定因素。三阴性乳腺癌（TNBC）以雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）表达缺失为定义，具有侵袭性强、早期复发和远处转移风险高的特点，肺是其常见转移部位之一。通过体内筛选MDA-MB-231细胞获得高肺转移潜能的LM2衍生细胞，为研究TNBC肺转移提供了重要模型。因此，鉴定调控TNBC细胞迁移、侵袭和肺转移能力的分子对理解TNBC转移的分子基础具有重要意义。蛋白质糖基化是影响蛋白质折叠、稳定性、质膜定位及细胞-细胞和细胞-基质相互作用的重要翻译后修饰。异常N-糖基化通过改变黏附分子、受体及其他膜蛋白的结构与功能，促进肿瘤细胞迁移、侵袭和转移。MAN1A1（mannosidase alpha class 1A member 1）编码一种高尔基体定位的α-1,2-甘露糖苷酶，在N-糖链成熟过程中修剪甘露糖残基。除调控N-糖链结构外，MAN1A1还可影响特定膜蛋白的定位与功能：在乳腺癌细胞中参与钠/碘同向转运体（NIS）的正常N-糖基化及质膜转运；在胶质瘤干细胞中调节CD133的N-糖基化状态，进而影响分子相互作用和细胞表型。MAN1A1在乳腺癌中的作用似乎随分子亚型和疾病进展阶段而异：早期研究报道较高的MAN1A1表达与较好的乳腺癌预后相关，且在luminal亚型中预后价值最强；后续研究显示低MAN1A1蛋白水平与不良临床病理特征和生存结局相关，且MAN1A1敲低降低MDA-MB-231细胞的迁移能力；近期对正常乳腺组织、原发肿瘤和转移灶的比较进一步表明，MAN1A1蛋白表达在疾病进展中发生变化，而非遵循简单的单向模式；此外，一项针对TNBC糖基化相关基因的系统分析鉴定出MAN1A1的异常表达。综上，这些发现表明MAN1A1在乳腺癌中具有情境依赖的作用，并支持进一步研究其在TNBC转移中的功能。基于此，研究人员系统刻画了MAN1A1在泛癌中的表达、临床相关性、分子改变及相关生物学程序，并进一步考察其与乳腺癌及TNBC进展的关系；随后结合功能缺失与功能获得方法、体外迁移侵袭实验及实验性肺转移模型，确定MAN1A1在TNBC转移相关表型中的功能作用；最后整合转录组和肿瘤微环境分析，界定TNBC中与MAN1A1相关的分子程序。研究得出结论：MAN1A1促进TNBC细胞迁移、侵袭和实验性肺转移，并伴随细胞黏附、ECM重塑、迁移和炎症相关转录程序的改变；值得注意的是，CDH2和VCAM1在MAN1A1敲低与过表达后表现出相反的转录变化，进一步支持MAN1A1与黏附相关程序的关联。这些发现支持MAN1A1在TNBC转移进展中的作用，并为界定其下游糖蛋白靶点和分子机制提供了基础。
关键技术方法：研究人员利用UCSC Xena获取TCGA与GTEx统一处理的RNA-seq表达及表型数据，行泛癌差异表达、生存（Cox回归）与分子改变分析；采用HPA单细胞数据及免疫组化图像分析细胞类型分布与蛋白表达；基于MSigDB Hallmark基因集开展GSEA与过表达分析（ORA）；使用ImmuCellAI、TIMER、xCell和ssGSEA评估免疫浸润；公共数据队列包括TCGA-BRCA、TCGA-TNBC（123例）及GEO数据集GSE21653、GSE2603、GSE32489；细胞模型为LM2与MDA-MB-231（MDA-MB-231-LM2细胞由中国科学院上海营养与健康研究所Guohong Hu教授惠赠）；功能实验采用Transwell迁移与侵袭实验及裸鼠尾静脉注射实验性肺转移模型（雌性BALB/c-nu/nu小鼠，每组n = 4）；分子检测采用qPCR与Western blotting；LM2-shNC与LM2-shMAN1A1#2细胞行RNA-seq（每组n = 3）及差异表达分析。
研究结果：
3.1 MAN1A1在癌种与细胞群体间呈现异质性表达：通过TCGA/GTEx分析发现MAN1A1在肿瘤与正常组织间的表达差异具有癌种特异性，在BRCA、CESC、COAD、READ等癌种中肿瘤表达低于正常组织，而在LAML、STAD、PAAD中肿瘤表达较高；HPA免疫组化显示乳腺、结肠、肝、胃、肾的正常与肿瘤组织均可检测到MAN1A1蛋白；单细胞分析显示MAN1A1在巨噬细胞、浆细胞和中性粒细胞等免疫群体中表达较高，在成纤维细胞、内皮/壁细胞及多种上皮细胞类型中亦有表达。
3.2 MAN1A1的预后关联与分子改变随癌种而异：泛癌单变量Cox回归分析中，105个可评估比较里8个呈名义统计学显著，但经Benjamini–Hochberg FDR校正后均未保持显著；整合体细胞突变、拷贝数变异与mRNA表达改变分析显示，MAN1A1的改变主要归因于mRNA表达改变和拷贝数变化，体细胞突变相对少见。
3.3 MAN1A1在泛癌中与多样生物学及免疫程序相关：基于全基因组基因排序的Hallmark GSEA显示，多种癌种中富集免疫/炎症与基质相关程序，包括TNFα/NF-κB信号、IL2/STAT5信号、干扰素反应、补体、上皮-间质转化（EMT）、顶端连接和血管生成，而细胞周期相关程序（E2F靶点、G2M检查点、MYC靶点）在若干癌种中呈负富集；MAN1A1与HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRA、HLA-DQA1等抗原呈递相关基因在多种癌种中正相关，与免疫检查点分子的相关性则因癌种而异；免疫细胞浸润分析显示MAN1A1与CD4+ T细胞、调节性T细胞、巨噬细胞和中央记忆T细胞在多种癌症中正相关。
3.4 MAN1A1表达与乳腺癌预后、分子亚型及转移特征相关：TCGA-BRCA队列中MAN1A1高表达组总生存显著差于低表达组（log-rank p = 0.018），TCGA-TNBC亚组中同样如此（p = 0.014）；PAM50分析显示basal-like亚型MAN1A1表达较低；TCGA-BRCA与GSE21653均显示TNBC中MAN1A1表达低于非TNBC；GSE2603中高肺转移衍生亚系MAN1A1表达数值上高于亲本细胞但差异无统计学意义（p = 0.13）；GSE32489中肺转移灶MAN1A1表达高于非肺转移灶（p = 0.0352），远处转移灶高于淋巴结转移灶（p = 0.00823）。
3.5 MAN1A1促进TNBC细胞迁移、侵袭及实验性肺转移：两条独立shRNA有效降低LM2细胞MAN1A1 mRNA与蛋白表达，过表达显著提高MDA-MB-231细胞MAN1A1表达；Transwell实验显示敲低显著降低LM2细胞迁移（shMAN1A1#1，p < 0.01；shMAN1A1#2，p < 0.001）与侵袭（分别为p < 0.05和p < 0.001），过表达显著增强MDA-MB-231细胞迁移与侵袭（均p < 0.001）；尾静脉注射模型中，第21天和第32天敲低组肺生物发光信号显著降低（均p < 0.05），终点肺大体检查转移负荷减少，H&E染色显示敲低组肺内肿瘤面积比例显著降低（p < 0.01）。
3.6 整合转录组分析将MAN1A1与黏附、ECM重塑、迁移及炎症程序相联系：LM2-shMAN1A1#2与shNC的RNA-seq鉴定出286个显著差异表达基因（DEG），其中85个上调、201个下调；对201个下调基因的Hallmark ORA显示EMT、TNFα/NF-κB信号、KRAS信号上调、干扰素-γ反应、炎症反应、同种异体移植排斥及IL6/JAK/STAT3信号过表达；功能热图显示ECM、黏附与迁移相关基因协同下调，包括LRRC15、COL8A1、HAS2、MMP1、VCAM1、ITGA1、WNT5A、PLPP3和ELK3，并伴HLA-DPA1、HLA-DRA、HLA-DMB及Rho GTP酶/细胞骨架调控相关基因改变；TCGA-TNBC分析鉴定出MAN1A1高、低表达组间2283个显著DEG，GSEA显示高表达组中EMT、干扰素-γ反应、炎症反应、IL2/STAT5信号、补体、TNFα/NF-κB信号及IL6/JAK/STAT3信号正富集，低表达组富集MYC靶点、E2F靶点、氧化磷酸化、G2M检查点及若干代谢程序；LM2 RNA-seq与TCGA-TNBC共有58个共享DEG，富集于白细胞细胞间黏附、T细胞活化、细胞-基质黏附、MHC II类蛋白复合物组装、细胞黏附分子、Th17细胞分化及抗原加工与呈递；方向特异性交集进一步鉴定出41个在LM2敲低后下调、在MAN1A1高表达TCGA-TNBC肿瘤中上调的基因，GO-BP富集突出白细胞细胞间黏附与抗原加工呈递，KEGG分析鉴定出细胞黏附分子、造血细胞谱系及免疫相关通路；qPCR证实两种shRNA敲低后CDH2、PLPP3、VCAM1、HAS2、MMP1和WNT5A显著降低，ELK3仅在shMAN1A1#2细胞中显著降低；在MDA-MB-231细胞中，MAN1A1过表达显著增加CDH2与VCAM1表达（p < 0.05），而ELK3、HAS2、MMP1、PLPP3和WNT5A无统计学显著变化。
3.7 MAN1A1表达与TNBC免疫及基质微环境特征相关：基于TIMER、xCell和ssGSEA的免疫微环境分析显示TCGA-TNBC中MAN1A1高、低表达组存在差异，高表达组多种髓系和淋巴系群体浸润相关信号较高，包括树突状细胞、中性粒细胞、CD4+与CD8+ T细胞及巨噬细胞；髓源性抑制细胞（MDSC）、免疫检查点阻断（ICB）抵抗、中性粒细胞、癌症相关成纤维细胞（CAF）、肌成纤维细胞性CAF（myCAF）及EMT相关特征亦存在差异；高表达组ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore更高。
讨论部分总结：本研究通过整合泛癌分析、乳腺癌与TNBC队列、功能实验及转录组数据，探讨了MAN1A1在TNBC转移中的作用。MAN1A1在表达、预后、分子改变及相关生物学程序方面呈现显著的癌种异质性。在乳腺癌中，MAN1A1并未在TNBC中选择性高表达，但TCGA-BRCA队列及TNBC亚组内较高表达与较差总生存相关；转移相关数据集进一步将较高MAN1A1表达与肺及远处转移特征相联系。功能上，MAN1A1敲低降低LM2细胞迁移与侵袭并抑制实验性肺转移，而过表达增强MDA-MB-231细胞迁移与侵袭。转录组分析进一步将MAN1A1与黏附、ECM重塑、迁移、炎症及免疫相关程序相联系。作者指出MAN1A1的作用在不同肿瘤类型中存在差异：在肝细胞癌中较高表达与包括肿瘤侵袭在内的晚期临床病理特征相关，在卵巢癌中与较短无复发生存及远处转移相关；相反，在胆管癌中MAN1A1表达降低及高甘露糖N-糖链蓄积可促进迁移与侵袭；在结直肠癌肝转移相关恶性上皮细胞中亦观察到MAN1A1表达升高。乳腺癌中同样存在情境依赖模式：Milde-Langosch等发现MAN1A1的预后相关性在luminal亚型中最明显，Legler等报道低MAN1A1蛋白水平与不良临床结局相关且敲低降低MDA-MB-231细胞迁移，近期分析显示MAN1A1蛋白表达在疾病进展中变化但不遵循统一方向；本研究中MAN1A1在TNBC中表达低于非TNBC，而队列内较高表达与较差生存相关，转移数据集显示肺与远处转移中表达较高。功能数据支持MAN1A1在TNBC运动性和转移行为中的作用，与Legler等观察一致；但Rangel等报道在PTEN缺陷的HCC70和MDA-MB-468 TNBC模型中沉默MAN1A1加速原位乳腺脂肪垫肿瘤生长并将其鉴定为候选抑癌基因，作者认为所考察表型的差异可部分解释这一分歧：Rangel等关注原发肿瘤生长，而本研究考察迁移、侵袭和实验性肺转移，提示MAN1A1对原发肿瘤生长与转移行为的影响未必平行。MAN1A1的酶功能为这些转移表型提供了合理联系：作为参与N-糖链成熟甘露糖修剪的高尔基体α-1,2-甘露糖苷酶，N-糖基化调控参与肿瘤细胞迁移与侵袭的受体和黏附分子的构象、稳定性及质膜定位；在胶质瘤干细胞中MAN1A1调控CD133的N-糖基化状态及其与DNMT1的相互作用，从而影响慢周期行为、自我更新、化疗耐药和致瘤潜能；在乳腺癌细胞中MAN1A1还参与NIS/SLC5A5的糖基化与质膜转运。转录组数据进一步将MAN1A1与黏附、ECM、迁移和炎症相关程序相联系，LM2敲低后下调的201个基因中富集EMT、TNFα/NF-κB信号、干扰素-γ反应、炎症反应和IL6/JAK/STAT3信号，CDH2、VCAM1、HAS2、MMP1、WNT5A等代表性基因经qPCR显示一致变化，TCGA-TNBC分析显示类似关联，两者重叠进一步突出细胞黏附、T细胞活化、抗原加工及相关通路；方向特异性交集鉴定出41个基因并富集于细胞黏附和免疫相关过程，MDA-MB-231中过表达显著增加CDH2与VCAM1表达，与敲低模型中的下调互补，为MAN1A1与黏附相关转录程序（尤其涉及CDH2和VCAM1）的关联提供了额外证据。作者提出MAN1A1介导的N-糖链加工可能与TNBC黏附相关信号相联系，但指出由于N-糖链加工主要发生于翻译后水平，这些mRNA变化并不能确立CDH2或VCAM1被MAN1A1直接糖基化或调控，可能反映与糖蛋白功能改变或下游信号相关的间接转录反应，鉴定相关糖蛋白底物及其糖基化如何影响TNBC细胞迁移与侵袭将是未来机制研究的重要方向。免疫与炎症特征在泛癌和TNBC分析中一致出现，MAN1A1表达在多种癌症中与干扰素反应、TNFα/NF-κB信号、IL2/STAT5信号及抗原呈递相关基因相关；TCGA-TNBC中MAN1A1高表达肿瘤显示免疫细胞浸润、免疫相关特征及基质特征（包括CAF/myCAF和EMT相关特征）差异，并伴更高的ImmuneScore、StromalScore和ESTIMATEScore；糖基化可影响细胞表面受体、黏附分子和免疫调控蛋白的稳定性与识别，为MAN1A1介导的糖链加工与肿瘤微环境之间提供了潜在联系，但这些免疫关联的细胞基础仍需实验界定，且由于分析基于 bulk 肿瘤转录组数据，观察到的关联可能受组织细胞组成差异影响，因此应视为探索性结果，需进一步组织水平验证。作者还承认若干局限性：GEO转移相关数据集在样本量、表达谱平台和转移部位方面存在差异，且缺乏匹配的原发与转移TNBC组织标本，无法对转移进展中的MAN1A1蛋白表达进行免疫组化验证；尾静脉注射模型虽为肺转移定植提供有价值信息，但不能重现包括原发肿瘤生长、局部侵袭和自发血管内渗在内的完整转移级联，动物队列较小及体内仅使用单一MAN1A1靶向shRNA构建体也限制了结果的普适性与特异性；当前机制证据主要基于转录组分析，MAN1A1影响TNBC迁移与侵袭的具体糖蛋白底物及下游分子机制仍待阐明。未来纳入独立shRNA构建体、 rescue 实验、蛋白与糖链水平验证及匹配临床标本分析的研究，将对进一步界定MAN1A1在TNBC转移进展中的作用具有重要意义。研究结论：综上，MAN1A1促进TNBC细胞迁移、侵袭和实验性肺转移；整合转录组与临床分析进一步将MAN1A1与细胞黏附、ECM重塑、迁移和炎症程序相关联；值得注意的是，CDH2和VCAM1在MAN1A1敲低与过表达后表现出相反的转录变化，进一步支持MAN1A1与黏附相关程序的关联。这些发现支持MAN1A1在TNBC转移进展中的作用，并为界定其下游糖蛋白靶点和分子机制提供了基础。
