精确序列分析揭示肝细胞癌中跨犬、人类和小鼠数据集的小RNA片段重塑

《Genes》：Exact-Sequence Profiling Reveals Small RNA Fragment Remodeling in Hepatocellular Carcinoma Across Dog, Human, and Mouse Datasets

　　

背景/目的：肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）与微小RNA（microRNA, miRNA）表达改变相关，但小RNA测序（small RNA sequencing, sRNA-seq）分析通常按注释特征聚合读长。这种聚合可能掩盖单个miRNA序列变异体（isomiRs）以及转移RNA（transfer RNA, tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）和其他非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）衍生片段的变化。研究旨在以精确序列分辨率表征HCC相关小RNA变化。方法：研究人员分析了五个来自犬、人和小鼠的肝脏sRNA-seq数据集。主要犬、人（hsa-Tissue 1）和小鼠（mmu-Tissue 1）比较每组仅包括三个生物学样本。每个唯一读长序列作为分析单元保留，随后针对物种特异性RNAcentral参考序列进行注释。研究人员比较了序列水平和特征水平差异表达，表征了片段末端位置，并检查了数据集间序列共享和倍数变化（fold-change, FC）一致性。结果：在犬HCC中，40,231个保留序列中有3520个差异丰度。序列水平分析解析了特征水平汇总中不明显的HCC相关isomiRs和tRNA衍生片段，其他变化涉及rRNA衍生和未注释序列。若干RNA类别显示与选择性加工或稳定化相符的反复杂末端模式。数据集间共享的精确序列显示HCC相关变化的数据集依赖性一致性，包括两个人类数据集之间有限的一致性。结论：精确序列分析通过区分单个小RNA序列中的HCC相关变化补充特征水平定量，并为功能研究提供候选片段。小样本量以及疾病背景、对照组织和文库制备的差异限制了对单个候选片段和跨数据集比较的解释。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中微小RNA（microRNA, miRNA）表达失调已被广泛报道，但小RNA测序（small RNA sequencing, sRNA-seq）常规流程将读长（reads）映射到注释特征并在特征水平汇总，可能合并同一参考RNA来源的不同序列，并排除未注释读长。异构体（isomiRs，miRNA序列变异体）及转移RNA（transfer RNA, tRNA）、核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA, snoRNA）和Y RNA衍生片段也存在于Argonaute复合物中，部分可调控基因表达。跨物种比较还受物种特异性非编码RNA（non-coding RNA, ncRNA）参考目录差异影响。因此，研究人员以精确核苷酸序列为分析单元，分析犬、人和小鼠五个肝脏sRNA-seq数据集，以识别HCC相关序列水平变化和候选片段。

关键技术方法（≤250字）：研究人员使用五个肝脏sRNA-seq数据集：犬cfa-Tissue（in-house，NCBI BioProject PRJNA1293103）、人hsa-Tissue 1（PRJNA589528）和hsa-Tissue 2（PRJNA716180）、小鼠mmu-Tissue 1（PRJNA643276）和mmu-Tissue 2（PRJNA522967）。流程以精确序列为分析单元，保留每百万计数（counts per million, CPM）>1且在至少两个样本中检出的序列，并以RNAcentral release 22物种特异性参考注释。序列级差异丰度采用CLC/TMM负二项广义线性模型和edgeR/upperquartile（UQ）分析，仅将两种分析均达到错误发现率（false discovery rate, FDR）<0.05的序列视为差异丰度；并进行末端位置、序列共享、log₂FC一致性和RNA类型富集分析。

3.1 精确序列分析揭示跨多种小RNA类的HCC相关重塑（Exact-Sequence Profiling Reveals HCC-Associated Remodeling Across Diverse Small RNA Classes）：通过五个数据集建立精确序列框架，犬cfa-Tissue中3520/40,231个保留序列差异丰度；在|log₂FC|>4的强变化序列中，未注释序列平均CPM最高，其次为tRNA和rRNA衍生片段；多比较中差异序列富集于tRNA、rRNA衍生及无miRNA/pre-miRNA注释序列。结论为HCC相关sRNA重塑超出经典miRNA，涉及多种非经典小RNA片段。

3.2 序列水平分析识别特征级聚合掩盖的HCC相关片段（Sequence-Level Analysis Identifies HCC-Associated Fragments Masked by Feature-Level Aggregation）：通过cfa-Tissue比较参考特征定量与精确序列分析，参考分析识别43个差异miRNA和30个差异成熟tRNA特征；11个经典miRNA在两种方法中均显著且方向一致，32个仅参考分析显著；cfa-miR-339和cfa-miR-153由完全匹配序列驱动，而cfa-miR-192和cfa-miR-143的显著变化限于部分组成序列；部分高丰度tRNA特征参考水平不显著而组成精确序列显著。结论为特征级聚合可掩盖特定isomiRs和tRNA衍生片段的HCC相关变化。

3.3 反复杂末端模式与选择性加工或稳定化相符（Recurrent Terminal Patterns Are Compatible with Selective Processing or Stabilization of Small RNA Fragments）：通过分析注释片段相对参考RNA的5′和3′末端位置，发现片段优先来源于转录末端，5′端信号最强，pre-miRNA和tRNA尤为明显；tRNA(Glu)衍生片段主要来自5′区域，tRNA(Asn)衍生片段常延伸至3′ CCA末端；人数据中健康肝以5′衍生片段为主，HCC和癌旁样本3′衍生片段贡献增加；snoRNA衍生片段呈双峰，snRNA和rRNA衍生片段偏3′，Y RNA衍生片段主要5′，lncRNA衍生片段末端富集较弱；miRNA、pre-miRNA和piRNA的错配及短末端延伸集中于3′端，5′端相对稳定。结论为这些模式符合选择性加工或稳定化，但随机降解不能排除。

3.4 共享精确序列显示HCC相关变化的数据集依赖性一致性（Shared Exact Sequences Show Dataset-Dependent Concordance of HCC-Associated Changes）：通过Ochiai指数和重叠系数比较共享序列，cfa-Tissue与hsa-Tissue 1序列集相似性最高；共享序列HCC相关log₂FC相关性为两个人数据集ρ=0.15、hsa-Tissue 1与mmu-Tissue 1 ρ≤0.15、cfa-Tissue与hsa-Tissue 1 ρ=0.43、mmu-Tissue 1与mmu-Tissue 2 ρ=0.46、cfa-Tissue与mmu-Tissue 1 ρ=0.33；RNA类别分层中miRNA/pre-miRNA片段共享最多，cfa-Tissue与hsa-Tissue 1共享miRNA/pre-miRNA片段ρ=0.44，而mmu-Tissue 1与hsa-Tissue 1为ρ=0.06；三个物种同向增加的序列包括miR-182-5p、miR-183-5p及其isomiRs和rRNA、tRNA(Tyr)衍生片段，小鼠早期变化涉及3′-trimmed isomiRs。结论为一致性依赖数据集，不能支持动物模型普遍排序或统一保守性。

讨论部分指出，精确序列分析不替代参考特征定量，而是补充层次；其可保留生物学上不同的序列变异体，并降低但未消除对物种注释目录的依赖；末端模式提示候选功能片段，但未证明功能。跨数据集一致性受疾病病因、分期、对照组织、文库制备和样本量影响，尤其hsa-Tissue 2以癌旁组织为对照；因此相关性为探索性，不支持模型排名。rRNA衍生片段内部区域信号提示多种加工途径。局限性包括连接偏倚、技术伪影、注释不完整、归一化方法在稀疏序列矩阵和小样本中的适用性、精确序列比较保守以及未直接测试功能；未来需验证Argonaute关联、非连接依赖方法和功能实验。研究结论翻译：精确序列分析揭示HCC相关sRNA重塑超出经典miRNA，包括isomiRs及tRNA、rRNA和其他ncRNA衍生片段；序列水平分析解析了特征级聚合掩盖的变化，并识别与选择性加工或稳定化一致的反复杂末端模式；数据集间共享精确序列比较识别出一致HCC相关变化，包括miR-182-5p和miR-183-5p isomiRs，但也存在显著数据集异质性。这些发现支持精确序列分析作为传统特征定量补充方法，并为HCC未来机制验证提供候选小RNA片段。