蒙古绵羊卵巢中ADAMTS1与PI3K/Akt通路基因在不同产羔表型中的表达差异

《Genes》：Ovarian Expression of ADAMTS1 and PI3K/Akt Pathway Genes in Mongolian Sheep with Different Lambing Phenotypes

　　

背景：ADAMTS1参与卵巢细胞外基质重塑和排卵，但其与蒙古绵羊繁殖性能的关系尚需进一步研究。本研究比较了有单胎和双胎产羔记录的母羊卵巢中ADAMTS1和PI3K/Akt通路相关基因的表达，并检测了培养的颗粒细胞（GCs）对LY294002的反应。方法：选取24只蒙古母羊，其中12只在至少连续两个产羔季节有单胎记录，12只有双胎记录。每组包括发情期和间情期各6只。采用逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）评估卵巢基因表达。培养的GCs通过免疫荧光检测，并用15 μmol/L LY294002或二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂对照处理。结果：两个双胎史组卵巢中ADAMTS1、PI3K、Akt和PTEN的mRNA水平均高于任一单胎史组（p < 0.05）。Bcl-2表达在双胎史发情期组最高，而BAX表达在两个产羔史类别中间情期均高于发情期（p < 0.05）。LY294002处理后，生长相关的450 nm吸光度降低，ADAMTS1和多个通路相关转录本下调。双胎史组中BAX mRNA显著升高（p < 0.05），但单胎史组的增加不显著（p > 0.05）。结论：这些发现表明与记录的产羔史和细胞对LY294002的反应有关联。它们并未确立ADAMTS1与PI3K/Akt信号之间的直接调控关系或其在双胎中的因果作用。类固醇生成功能、促性腺激素反应性和凋亡需要直接的功能验证。

论文解读文章

研究背景与目的

蒙古绵羊是适应蒙古高原的本土品种，提高其繁殖性能对生产具有重要意义，但产仔数受遗传背景、卵巢功能和环境条件等多种因素影响。ADAMTS1是一种金属蛋白酶家族成员，参与卵泡发育和排卵过程中的细胞外基质重塑。已有研究探讨了ADAMTS1在蒙古绵羊繁殖中的作用，但尚未明确其与胞内信号通路的相互作用如何导致产仔数变异。本研究旨在通过比较不同产羔史（单胎与双胎）蒙古母羊卵巢中ADAMTS1和PI3K/Akt通路相关基因的表达，并观察培养的颗粒细胞（GCs）对PI3K抑制剂LY294002的转录响应，为后续功能研究提供初步证据。

研究方法

研究人员从内蒙古盛乐生物科技有限公司的商业屠宰场采集卵巢样本，基于个体产羔记录选取24只蒙古母羊，其中12只连续至少两个产羔季节产单胎，12只产双胎，每组再分为发情期和间情期各6只。主要关键技术方法包括：

1. 1.
   原代颗粒细胞培养：从直径2-8 mm卵泡中抽吸卵丘-卵母细胞复合物（COCs），分离并培养原代GCs，传至第二代（P2）用于实验。
2. 2.
   免疫荧光检测：使用ADAMTS1单克隆抗体和FSHR一抗对P2代GCs进行免疫荧光染色，以定位蛋白表达。
3. 3.
   RT-qPCR分析：提取卵巢组织和GCs的总RNA，反转录后使用TB Green Premix Ex Taq? II进行定量PCR，检测ADAMTS1、PI3K、Akt、PTEN、RPS6、Bcl-2和BAX的mRNA相对表达量，以GAPDH为内参基因。
4. 4.
   PI3K抑制实验：用15 μmol/L LY294002（PI3K抑制剂）或等体积DMSO处理GCs，分别在0、24、48、72小时测定细胞计数，48小时观察形态，并使用CCK-8法检测450 nm吸光度（OD₄₅₀）评估细胞代谢活性，同时测量上述基因的表达变化。

研究结果

3.1 原代培养蒙古绵羊卵巢GCs的观察：从卵巢卵泡中分离的原代GCs贴壁后呈梭形或铺路石样形态，生长良好。

3.2 GCs中ADAMTS1和FSHR的免疫荧光定位：免疫荧光结果显示，ADAMTS1和FSHR在培养的P2代GCs中稳定表达，阴性对照组无特异性荧光。

3.3 卵巢中ADAMTS1和PI3K/Akt通路相关基因的表达：

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  ADAMTS1：双胎史发情期组表达最高，其次为双胎史间情期组，两个单胎史组均较低（p < 0.05），且单胎史两组间无显著差异。
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  PI3K：双胎史两组均高于单胎史两组（p < 0.05），同产羔史类别内发情期与间情期间无显著差异。
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  Akt：四组间均有显著差异，表达量由高到低为：双胎史发情期、双胎史间情期、单胎史间情期、单胎史发情期（所有配对p < 0.05）。
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  PTEN：双胎史两组间无显著差异，但均高于单胎史间情期组，后者又高于单胎史发情期组（p < 0.05）。
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  RPS6：双胎史发情期与单胎史发情期组相当（p > 0.05），两者均高于双胎史间情期组，单胎史间情期组最低（p < 0.05）。
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  Bcl-2：双胎史发情期组最高，双胎史间情期组居中，两个单胎史组最低（p < 0.05），后两者间无显著差异。
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  BAX：双胎史间情期组最高，单胎史间情期组次之，两个发情期组均较低（p < 0.05），两发情期组间无显著差异。

以上结果表明，卵巢表达谱因产羔史和生殖阶段的组合而异。阶段相关差异在双胎史类别中见于ADAMTS1和Bcl-2，在单胎史类别中见于PTEN，在两类中均见于Akt、RPS6和BAX。PI3K在两类内均无显著阶段差异。产羔史的关联也呈基因和阶段依赖性：BAX在两间情期组间有差异但两发情期组间无，RPS6则在两间情期组间有差异但两发情期组间无。

3.4 PI3K抑制后GCs中ADAMTS1和PI3K/Akt通路基因表达的变化：与DMSO对照组相比，LY294002处理后的GCs在24、48、72小时的CCK-8衍生OD₄₅₀值显著降低（p < 0.05），提示细胞代谢活性下降。基因表达分析显示，处理组中ADAMTS1、PI3K、Akt、PTEN、增殖相关基因RPS6和抗凋亡基因Bcl-2的mRNA水平显著低于对照组（p < 0.05）。BAX mRNA在双胎史发情期和间情期组中显著升高（p < 0.05），但在单胎史发情期和间情期组中的增加不显著（p > 0.05）。

讨论与结论

讨论：本研究发现卵巢ADAMTS1、PI3K、Akt和PTEN mRNA水平在双胎史母羊中高于单胎史母羊，但这一关联并不确立因果关系。产羔史分组基于连续至少两个产羔季节的记录，而非终生一致性或遗传固定的繁殖表型，且样本量较小（每亚组6只），缺乏纵向和系谱信息，限制了结果的普适性。LY294002处理后，生长相关OD₄₅₀降低伴随ADAMTS1和多个PI3K/Akt通路基因转录本下调，这与PI3K敏感过程参与维持GC生长一致，但转录丰度不能直接衡量通路活性，且未检测磷酸化水平。凋亡相关基因的转录响应存在组间差异：BAX mRNA在双胎史组中显著升高，Bcl-2在双胎史发情期、间情期和单胎史发情期组中显著下降，但单胎史间情期组变化不显著。这些变化提示某些组向促凋亡转录谱偏移，但不能证明凋亡增加，需直接凋亡分析和蛋白水平测量。此外，培养的GCs虽表达FSHR，但未测定雌二醇（E₂）分泌，因此其类固醇生成能力和对促性腺激素的功能响应性未经证实，观察到的生长和转录反应不能外推至类固醇生成、排卵刺激响应性或排卵能力。

结论翻译：卵巢ADAMTS1和选定的PI3K/Akt通路相关转录本在有单胎和双胎产羔记录的蒙古母羊之间存在差异。在培养的GCs中，LY294002处理降低了生长相关的OD₄₅₀测量值，并改变了ADAMTS1和相关基因的表达。这些结果支持进一步研究ADAMTS1与PI3K/Akt相关细胞过程之间的关系。然而，所记录的产羔史并不能确立终生的繁殖一致性或可遗传的双胎表型。E₂产生和促性腺激素反应性未进行评估，且在修订过程中未进行额外的相关功能实验。因此，本研究未能确定ADAMTS1直接调控PI3K/Akt信号、类固醇生成、排卵或双胎。在得出因果结论或应用于育种之前，需要扩展繁殖记录和有针对性的功能验证。