阿利坎特（Alicante）本土人群12个X染色体短串联重复序列（X-STR）位点的法医遗传学特征与群体遗传学分析：基于Investigator Argus X-12 QS体系的最大区域参考数据库构建

《Genes》：Extending the Genotypes and Phenotypes of C1QTNF5-Associated Retinal Disease

　　

背景/目的：X染色体短串联重复序列（X-STR）可补充常染色体与Y染色体标记，在法医遗传学中尤其适用于亲缘关系鉴定与个体识别。本研究拓展了此前关于阿利坎特（西班牙东南部）X-STR变异的研究，构建了迄今针对特定西班牙人群最大的区域性X-STR参考数据库，该数据库包含并扩展了先前报道的预试验样本。方法：对316名无亲缘关系的第三代本土个体采用Investigator Argus X-12 QS试剂盒对12个X-STR位点进行基因分型。分析了法医遗传学参数、单倍型分布及连锁不平衡（LD），并辅以多等位基因位点间关联的归一化熵差（NED）分析。采用成对F_ST值评估与欧洲、拉丁美洲及地中海人群的群体间分化。结果：所有标记均显示较高的遗传多样性（GD 0.676–0.927；PIC 0.623–0.922），四个连锁群的单倍型多样性为0.989–0.997。在66个成对位点比较中，16个显示名义上的LD证据（p < 0.05），其中4个经Bonferroni校正后仍显著。阿利坎特与其他欧洲人群分化较低，与若干拉丁美洲人群呈中度分化，与若干地中海人群（尤其是北非柏柏尔人群与伊比利亚地中海人群）分化较低。鉴于参考数据集在样本量、抽样设计和区域来源方面的异质性，上述比较应谨慎解读。结论：研究结果支持Investigator Argus X-12 QS panel在阿利坎特人群中的法医适用性，并为亲缘关系鉴定、个体识别及未来比较群体遗传学研究提供了参考数据库。

本研究旨在系统刻画西班牙东南部阿利坎特省本土人群的X染色体遗传多样性，以弥补该地区在Investigator Argus X-12 QS体系下缺乏专门群体数据的空白。X-STR因X染色体特有的性别特异性遗传模式，在复杂亲缘关系鉴定、家系重建、失踪人员识别、乱伦案件、移民案件及大规模灾难遇难者识别中具有重要价值，当Y-STR或常染色体STR无法提供信息时尤为有用。由于X-STR均位于同一染色体上，部分标记并非独立分离，已识别出位于Xp22、Xq12、Xq26和Xq28四个区域的四个主要连锁群，群内标记紧密连锁，因此在法医与亲缘关系分析中应以单倍型频率而非单个等位基因频率为基础，而全面的群体数据库对于准确估计单倍型频率至关重要。此前西班牙人群中应用Investigator Argus X-12 QS体系者仅限于萨莫拉、瓦伦西亚和巴利阿里群岛，阿利坎特仅有初步预试验样本，本研究在此基础上有显著扩展。

研究人员对316名无亲缘关系的第三代本土个体（196名男性、120名女性）进行研究，其中纳入既往已分析的121名个体（62男、59女）并新增195名无亲缘关系个体（134男、61女）。本土性纳入标准为参与者本人及其父母和全部四位祖父母均出生于阿利坎特省，以确保至少三代本地血统，并收集参与者及其父母、祖父母出生市镇信息以核验该标准；研究未设市镇配额，也未与全省人口进行正式人口学比较，本土性仅作为纳入标准而非遗传同质性证据。参与者从米格尔·埃尔南德斯大学健康科学领域的学生和志愿者中招募，均签署书面知情同意书，采样为非概率抽样。研究得出，所分析标记遗传多样性高，四个连锁群单倍型多样性极高，法医遗传学参数支持该体系在阿利坎特人群中的适用性；与欧洲人群分化低，与部分拉丁美洲人群中度分化，与地中海人群尤其是北非柏柏尔和伊比利亚地中海人群分化低；研究构建了西班牙特定地理区域迄今最大的群体数据库，将该商业体系的地理覆盖扩展至第四个西班牙人群，为亲缘关系鉴定、个体识别及未来比较群体遗传学研究提供参考。其重要意义在于补充了现有基于GHEP-ISFG decaplex及17个STR的伊比利亚资源以及更广泛西地中海X-STR图景，为西班牙东南部法医与群体遗传学应用提供了最新参考框架。

在技术方法上，研究人员采集316份口腔拭子样本，采用DNA IQ? System提取DNA并经NanoDrop? Lite Plus分光光度法定量，使用Investigator Argus X-12 QS试剂盒进行PCR扩增，在SeqStudio Genetic Analyzer上进行毛细管电泳，并用GeneMapper?软件v4.1进行基因分型。统计分析方面，采用Arlequin v3.5.2.2进行Hardy–Weinberg平衡（HWE）检验和连锁不平衡精确检验（基于10 000步马尔可夫链及1000步去记忆步骤），以Microsoft Excel计算等位基因频率、单倍型频率和遗传距离，并借助ChrX-STR在线数据库平台计算法医遗传学参数；采用Shannon熵及归一化熵差（NED）评价多等位基因位点间关联；以基于Nei（1973）G_ST公式的F_ST量化群体间分化；采用主坐标分析（PCoA，经典度量多维标度）与Neighbor-Joining树进行群体关系可视化，分别通过Python 3.13.18（NumPy 2.5.3、Matplotlib 3.10.8）和MEGA 12.1.2实现。样本队列来源为西班牙阿利坎特省本土人群，比较分析纳入除阿利坎特外26个群体，其入选依据为Investigator Argus X-12试剂盒所含12个X-STR标记遗传数据的可及性及参考群体样本使用无亲缘关系个体。

研究结果如下。3.1 法医遗传学参数分析：对316名无亲缘关系个体的12个X-STR标记（DXS8378、DXS10135、DXS10148、DXS7132、DXS10074、DXS10079、HPRTB、DXS10101、DXS10103、DXS7423、DXS10134、DXS10146）进行分析，各标记最常见等位基因分别为10、22、24.1、14、17、19、12、30.2、19、15、36和29；GD最低与最高者分别为DXS7423（0.6759）和DXS10135（0.9270），PIC为0.6226（DXS7423）至0.9222（DXS10135）；DXS10146（p = 0.00595）和DXS10079（p = 0.03859）呈名义性HWE偏离，但经Bonferroni校正（p < 0.00417）后无显著偏离。3.2 阿利坎特男性单倍型与连锁不平衡分析：在196名男性中，66个位点对里16对呈名义显著关联（p < 0.05），经Bonferroni校正（阈值p < 0.000758）后4对仍显著，即DXS10103–DXS10101、DXS10103–HPRTB、DXS10101–HPRTB和DXS10101–DXS10074，前三对属连锁群3（LG3），最后一对涉及LG3与LG2的不同连锁群位点。按染色体定位将12个标记划分为LG I（Xp22）、LG II（Xq12）、LG III（Xq26）和LG IV（Xq28）；男性单倍型多样性分别为LG I 0.9971、LG II 0.9925、LG III 0.9890、LG IV 0.9949。对66个标记对计算NED，值为0.015–0.26，随理论单倍型组合数增加呈上升趋势，提示组合潜力越大则联合等位基因多样性越高。3.3 与欧洲及历史上与西班牙相关联人群的遗传分化分析：将阿利坎特与巴西、阿根廷、墨西哥、哥伦比亚、厄瓜多尔、菲律宾、斯洛伐克、克罗地亚、捷克、德国和葡萄牙共11国人群比较（部分参考数据集为相应国家内特定区域或局部样本）。F_ST矩阵的PCoA前三轴解释99.5%的总变异（PC1 = 76.6%；PC2 = 21.8%；PC3 = 1.1%）；阿利坎特靠近大陆欧洲人群聚类，最小距离为德国（0.002061）、克罗地亚（0.002362）、斯洛伐克（0.002369）、捷克（0.002555）和葡萄牙（0.002809），与中欧人群彼此间数值（0.000645–0.000923）同量级；葡萄牙沿PC1正端相对菲律宾方向位移，与菲律宾（0.088870）和厄瓜多尔（0.100122）的成对F_ST相对较高；PC2主要将阿根廷与其余人群分离。所有人群在DXS7423均共享最常见等位基因15；阿利坎特与欧洲人群在HPRTB共享等位基因12；阿利坎特与菲律宾在DXS10135和DXS10148共享等位基因22和24.1。等位基因多样性最大者为哥伦比亚，其次墨西哥，DXS10135位点哥伦比亚有40种不同等位基因，为阿利坎特（20种）的两倍，菲律宾该位点变异较低（18种）；全部标记的不同等位基因总数哥伦比亚最多（239种），其次墨西哥（227种）和德国（219种）。PCoA显示阿根廷与厄瓜多尔离其余人群遗传距离较大，而德国、捷克、克罗地亚、斯洛伐克、葡萄牙和阿利坎特构成界限清晰的聚类，提示分化低；阿根廷总体遗传距离最大。3.4 与地中海人群的遗传分化分析：以15个地中海人群等位基因频率计算成对F_ST，并将其分为五组，即伊比利亚地中海组（马略卡、梅诺卡、伊维萨和瓦伦西亚）、北非地中海组（摩洛哥阿拉伯人、摩洛哥柏柏尔人和摩洛哥撒哈拉威人）、中地中海组（雷焦卡拉布里亚、科森扎、卡坦扎罗、西西里和撒丁岛）、东亚得里亚组（阿尔巴尼亚）和东地中海组（黎巴嫩和土耳其）。多数成对比较F_ST低于0.01，提示分化低；分化最高者主要与伊维萨、科森扎和摩洛哥撒哈拉威人群相关。阿利坎特与所有分析人群F_ST均较低，最低为摩洛哥柏柏尔人（0.000711），最高为意大利科森扎（0.009619）；与地理最近人群分化有限，瓦伦西亚0.004094、马略卡0.003681、梅诺卡0.004201，而与伊维萨分化较大（0.007144），伊维萨在伊比利亚人群中持续显示较高F_ST，为该组中分化最大者。北非地中海人群分化亦低，摩洛哥阿拉伯人与柏柏尔人彼此及与若干伊比利亚人群分化相对较低，全数据集最低成对F_ST见于瓦伦西亚与摩洛哥阿拉伯人之间（0.000135）。中地中海组内西西里与撒丁岛成对F_ST较低（0.002064），科森扎为所分析意大利人群中分化最高者。阿尔巴尼亚与多数地中海人群分化低，尤其与阿利坎特（0.001171）和梅诺卡（0.002036），但与伊维萨（0.010016）和科森扎（0.010749）相对较高。东地中海组黎巴嫩与土耳其彼此高度相似（0.001553），并与中地中海人群尤其雷焦卡拉布里亚相似（分别为0.000389和0.000824）。基于成对F_ST距离矩阵构建的Neighbor-Joining树解析出两大分支：第一支以梅诺卡和阿尔巴尼亚与阿利坎特位于基部，并在较深节点与伊维萨、马略卡、瓦伦西亚及摩洛哥阿拉伯人和柏柏尔人相聚，其中伊维萨因分支较长而相对独立，与其在伊比利亚地中海人群中较高的成对分化一致；第二支包括中地中海与东地中海人群（撒丁岛、卡坦扎罗、西西里、雷焦卡拉布里亚、土耳其和黎巴嫩）以及摩洛哥撒哈拉威人，科森扎为全树分化最大的分支；摩洛哥撒哈拉威人与中/东地中海分支聚类而非与摩洛哥阿拉伯人和柏柏尔人聚类，后两者反而与阿利坎特同处伊比利亚分支，该拓扑分歧可能与既往报道的北摩洛哥人群与撒哈拉威人群间的遗传差异相符；整体分支长度与上述F_ST值相呼应，科森扎与伊维萨为分化最大者，阿利坎特则稳定嵌套于低分化的伊比利亚与北非地中海人群之中。

讨论部分总结如下：本研究对阿利坎特本土人群12个X-STR标记的系统刻画提供了更稳健的统计数据；既往西班牙人群的较大协作数据集主要旨在通过合并多个区域人群构建全国尺度等位基因频率数据库，而本研究聚焦单一区域人群的全面刻画，是迄今西班牙特定地理区域建立的最大群体数据库，并将该商业体系的地理覆盖扩展至第四个西班牙人群。研究强调严格纳入无亲缘关系且至少三代本土的个体，虽此类标准在已发表X-STR群体研究中未被统一采用，但有助于减少近期迁移的潜在影响并使等位基因频率估计更好反映历史区域基因库，对法医应用尤为重要；然而抽样非概率性，样本不能视为阿利坎特全人群的严格代表，选择偏倚不能排除，且未进行地理分层分析。由于X-STR高度变异会产生大量罕见单倍型，需扩大数据库样本量以获得稳健的单倍型频率估计并充分检测标记间连锁不平衡。研究显示遗传多样性高，最多样的标记为DXS10135、DXS10101、DXS10146、DXS10148和DXS10134，提示高等位基因异质性与高鉴别能力；多数标记的高PD、PE和PIC值支持其作为个体识别与亲缘关系分析信息工具，与使用同一试剂盒的众多群体研究一致；Bonferroni校正后无显著HWE偏离，表明未检测到所分析位点的不平衡证据，支持该人群用于法医等位基因频率估计。X-STR标记组织为连锁群是X染色体主要特征之一，也是与法医遗传学常规使用的常染色体STR的根本差异；由于群内标记物理距离短，某些等位基因组合比独立期望更常一起遗传，使连锁不平衡分析和单倍型频率在统计亲缘关系计算中必不可少，多位作者强调恰当刻画该单倍型结构是确保法医遗传学X-STR数据库稳健性的关键要求。本研究的法医遗传学参数描述的是各X-STR标记在群体层面的理论鉴别与排除能力，并非其在具体法医案件中的性能验证；亲缘关系分析中须考虑X-STR位点间连锁及潜在连锁不平衡，并在适用时结合适当单倍型频率与重组参数，FamLinkX等专用软件可用于基于X染色体标记的法医亲缘关系分析并进行考虑位点间连锁与重组的似然比计算，因此阿利坎特数据库可作为现有X-STR数据库之外的补充群体参考，遵循X染色体亲缘关系分析的既定建议，但不独立验证个案特异性似然比计算。四个连锁群单倍型多样性均高（0.9890–0.9971），表明研究人群在单倍型水平遗传变异极高。LD分析中16/66个位点对呈名义连锁不平衡证据；四个位点组合被Arlequin报告为p = 0.00000，即低于软件显示精度而非精确概率为零，前三对涉及LG3标记与其物理邻近一致，最后一对涉及LG3与LG2不同连锁群位点，不能直接归因于物理邻近，可能与抽样效应、群体结构或偶然有关；Bergseth等观察到男性单倍型少于约300时检测高度变异X-STR标记间LD的能力降低，故这些关联应谨慎解读并在更大样本中确认。在此背景下，引入NED分析是本研究主要方法学贡献之一：与基于p值的LD分析评估两位点关联的统计证据不同，NED以基于熵的描述性指标量化多等位基因位点间关联的幅度，并非旨在确立连锁不平衡的统计显著性，而是以连续指标量化单倍型结构关联程度，两者互补，LD评估关联的统计证据而NED描述该关联的相对幅度并便于不同标记组合与人群间比较。NED值为0.015–0.26，总体随理论单倍型组合数增加而增大，与Bergseth等一致，即NED不仅取决于位点间关联程度，还取决于等位基因复杂性和样本量，故观察到的NED值应谨慎解读，不应视为物理连锁或特定重组模式的直接证据。总体而言，将常规LD分析与NED评估相结合，比任一方法单独使用能更全面刻画连锁群的遗传结构；该方法近期才引入X-STR文献，在群体研究中应用仍很有限，故阿利坎特人群的结果拓展了这些标记单倍型组织的已有知识，并强化了该数据库在法医个体识别和复杂亲缘关系分析未来应用中的实用性。本研究还得出若干值得注意的发现：第一，DXS7423等位基因15在所考察欧洲、拉丁美洲和菲律宾人群中普遍存在，提示该位点无论地理或历史背景均高度保守；第二，阿利坎特与欧洲人群在HPRTB标记的较大等位基因亲和性与地理邻近人群共享遗传祖先一致；第三，哥伦比亚和墨西哥记录到的较高等位基因多样性可能反映拉丁美洲人群特有的原住民、欧洲和非洲遗传成分汇合所致的混合过程。图2分布应解读为相对遗传亲和性的描述而非已确立群体分化的证据，这对有效群体规模较小、可能增加对遗传漂变敏感性的X连锁标记尤为相关；阿利坎特与中欧人群的接近与欧洲既往描述的遗传距离和地理距离关系一致，可能反映历史基因流与地理连通性，阿利坎特与葡萄牙的接近可能与其在伊比利亚半岛的共同历史有关，但葡萄牙沿PC1相对菲律宾和厄瓜多尔的位移也可能受参考数据集间方法学差异（包括抽样策略或等位基因命名）影响。拉丁美洲人群间观察到的遗传差异可能部分反映其异质祖先构成和欧洲殖民相关人口过程；既往研究报道巴西有大量欧洲 ancestry、厄瓜多尔以美洲原住民 ancestry 为主，拉丁美洲历史混合还以欧洲父系贡献为主、美洲原住民和非洲母系贡献较大为特征，可能影响X染色体变异；阿根廷相对阿利坎特F_ST最高，可能反映萨尔塔人群的区域特征而非国家 ancestry 估计；菲律宾人群的分离可能与其东南亚遗传背景及既往研究报告的相对有限欧洲遗传贡献有关，尽管西班牙殖民管理逾三个世纪；总体这些模式可能与历史迁移和群体混合相符，但抽样策略差异和所分析X-STR标记数量有限使明确的 demographic 解释无法成立。就遗传分化而言，PCoA中欧洲人群的紧密聚类与既往报道的西欧和中欧人群低遗传分化一致；阿利坎特与巴西相对较低的遗传距离（相较其他拉丁美洲人群）可能归因于巴西人群显著的欧洲遗传贡献，而阿根廷和厄瓜多尔的明显遗传分化值得进一步研究，可能反映其特有的混合历史或奠基者效应。参考人群抽样策略和样本量的异质性是群体间比较的局限；观察到的等位基因数量差异可能部分反映样本量而非仅群体多样性，因为较大样本更可能捕获罕见等位基因；此外某些参考人群的区域来源以及高度多态位点（如DXS10148、DXS10135和DXS10146）等位基因命名的潜在差异，在解读F_ST值时均应考虑，故图2所示遗传关系应视为可能受抽样和方法学因素影响的描述性模式，而非群体分化的确定性证据。将阿利坎特与Ferragut等研究的人群以及撒丁岛、东亚得里亚的阿尔巴尼亚、东地中海的土耳其和黎巴嫩比较，提供了地中海背景的广泛代表性；遗传距离矩阵显示所分析地中海人群总体分化低，多数F_ST低于0.01；全矩阵最大距离见于科森扎与伊维萨之间，为分析中分化最大的群体对；相反雷焦卡拉布里亚与东地中海黎巴嫩和土耳其分化特别低，后者基于所分析X-STR标记也表现出低遗传分化。阿利坎特未显示孤立遗传轮廓或仅限地理邻近人群的亲和性，而是基于所分析X-STR标记显示与地中海不同区域人群的相似性；最低遗传距离见于摩洛哥柏柏尔人，其次阿尔巴尼亚，最高值对应科森扎；伊比利亚地中海人群F_ST中，伊维萨与阿利坎特及其余伊比利亚地中海人群分化较大，尽管这些值仍低，伊维萨相对分化的位置与Ferragut等一致，后者将这一模式与其隔离史及不同于邻近人群的母系背景相关联。该模式提示使用这些X-STR标记观察到的遗传关系并不严格反映地理距离，可能与整个地中海盆地发生的复杂人口历史与群体接触相符；地中海历来是迁移、贸易和文化交流的十字路口，为解读其人群间观察到的遗传关系提供了更广阔的历史背景。总体这些发现强化了X-STR标记作为群体间分化信息工具的法医与群体遗传学价值，并扩展了西班牙及历史上相关人群的参考数据库。该位置也与既往纳入阿利坎特样本的伊比利亚研究一致，这些研究发现所分析七个伊比利亚人群间无显著差异，但巴斯克地区、纳瓦拉和Pas Valley的本土人群例外，其较大分化归因于历史隔离；同样Prieto-Fernández等分析七个西班牙地区17个X-STR标记面板（包括56名阿利坎特男性样本）未检测到显著差异，从而可提出合并的西班牙数据库；尽管这两项研究使用的标记面板不同于Investigator Argus X-12 QS试剂盒，其发现支持阿利坎特与多数西班牙人群间无显著遗传亚结构；综上，这些结果提示无论采用何种X-STR多重体系，阿利坎特人群在更广泛伊比利亚遗传图景中均得到良好代表，而本研究具体扩展了西班牙可及的较有限Investigator Argus X-12 QS数据集（此前仅限于萨莫拉、瓦伦西亚和巴利阿里群岛）。本研究还应承认若干局限：尽管样本量足以刻画阿利坎特人群等位基因和单倍型频率，所分析男性数量仍可能有限，196个男性单倍型使位点间关联识别和四个连锁群刻画成为可能，但弱关联和罕见单倍型可能未被充分准确估计，增加男性样本量将可更精确估计罕见或未观察到的单倍型频率并改善连锁不平衡刻画。另一局限是缺乏比较人群的个体基因型，因多数已发表研究仅提供等位基因频率，这妨碍了应用其他分析方法（如STRUCTURE）进行群体归属分析或评估潜在混合成分，故比较仅限于F_ST距离及其通过三维PCoA和Neighbor-Joining树对所选人群的图形表示；未来获得完整遗传图谱将可更详细评估群体亚结构和所分析人群间关系。Investigator Argus X-12 QS试剂盒所含标记仅代表X染色体多态区域的部分选择，因此观察到的高多样性和人群间遗传关系描述的是该特定面板的行为，而不必然是其他X-STR、SNP、Alu插入或整个X染色体的行为；正如Ferragut等在其研究中所描述，同一地中海人群在分析X-STR或X-Alu插入时可能显示不同的分化模式，后者对检测群体结构的某些方面更敏感。法医遗传学近期进展突显了大规模并行测序（MPS）作为常规STR分型补充方法的潜力；Alonso等（2018）综述了MPS在法医STR分析中的应用，强调其识别常规毛细管电泳（CE）无法区分的相同片段长度等位基因间序列变异的能力，这种提高的序列分辨率可增强遗传标记的鉴别能力，尤其在复杂法医调查中，但作者也强调标准化等位基因命名、适当群体数据库和方法学验证对MPS在法医实践中实施的重要性；同样Dierig等（2024）证明MPS在含少量DNA的法医样本STR分型中优于常规CE，包括改善等位基因回收和识别基于长度分析未检测到的序列变异，但作者也强调与较高成本、较长处理时间和更复杂生物信息学分析要求相关的局限；此外de Toledo e Mello等（2025）使用CE和MPS评估12个X-STR标记面板，证明基于序列的分析能够识别仅凭片段长度无法区分的同形等位基因；最近Brancato等（2026）综述了新兴法医基因组技术，包括MPS、单核苷酸多态性（SNP）、微单倍型、法医遗传系谱学和基于人工智能的方法，这些技术在个体识别、复杂亲缘关系分析以及降解DNA样本和混合遗传图谱检验中提供互补应用，但其实施需要进一步标准化、验证和适当群体参考数据；在此背景下，常规X-STR群体数据库（如本研究提出的阿利坎特数据集）仍是法医遗传学调查的宝贵资源，并可为未来补充性基于序列的研究提供基础。总体而言，本研究为所分析12个X-STR标记在阿利坎特本土人群中提供了全面刻画的区域数据库，观察到的等位基因和单倍型多样性支持其作为个体识别和复杂亲缘关系分析的参考人群使用；该数据库因此构成具有法医相关性的区域资源，并有助于扩展西班牙人群及与其有历史关系人群的可及参考数据；通过填补Investigator Argus X-12 QS体系这一特定方法学和地理空白，本数据库补充了现有基于GHEP-ISFG decaplex和17个STR的伊比利亚资源以及更广泛的西地中海X-STR图景，为西班牙东南部法医与群体遗传学应用提供了最新参考框架。

研究结论（译）：研究结果支持Investigator Argus X-12 QS panel在阿利坎特人群中的法医适用性，并为亲缘关系鉴定、个体识别及未来比较群体遗传学研究提供了参考数据库。