《Genes》：chi-miR-27a-3p Negatively Modulates Dermal Papilla Cell Proliferation and Directly Targets Wnt7B in Inner Mongolia Cashmere Goat: Evidence for a Potential Melatonin–chi-miR-27a-3p–Wnt7B Regulatory Relationship
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背景：褪黑素（melatonin，MT）是内蒙古绒山羊季节性毛囊活动的重要调控因子，但介导褪黑素信号与真皮乳头细胞（dermal papilla cell，DPC）功能的miRNA相关机制尚不完全清楚。本研究探讨了chi-miR-27a-3p在褪黑素处理的DP
背景：褪黑素（melatonin，MT）是内蒙古绒山羊季节性毛囊活动的重要调控因子，但介导褪黑素信号与真皮乳头细胞（dermal papilla cell，DPC）功能的miRNA相关机制尚不完全清楚。本研究探讨了chi-miR-27a-3p在褪黑素处理的DPC中的作用。方法：研究人员从内蒙古绒山羊分离DPC，采用褪黑素处理或转导慢病毒载体实现chi-miR-27a-3p敲低或过表达。通过CCK8和Ki67免疫荧光评估细胞增殖，流式细胞术检测细胞周期分布和凋亡，双荧光素酶报告基因实验验证chi-miR-27a-3p与Wnt7B的相互作用；采用qRT-PCR和Western blotting检测Wnt7B、Wnt10b、β-catenin、SFRP1和DKK1的表达。结果：褪黑素处理伴随chi-miR-27a-3p表达下调。chi-miR-27a-3p过表达降低DPC增殖并增加凋亡，而其抑制则增加CCK-8信号、促进细胞周期进程并减少凋亡；敲低组Ki67荧光无显著变化。双荧光素酶实验表明chi-miR-27a-3p以序列依赖性方式直接靶向Wnt7B 3′-UTR，且chi-miR-27a-3p操作伴随Wnt7B、Wnt10b、β-catenin、SFRP1和DKK1表达的交互变化。结论：这些发现支持褪黑素、chi-miR-27a-3p与Wnt7B在DPC中可能存在调控关系；然而，chi-miR-27a-3p是否为褪黑素诱导增殖所必需，以及Wnt7B是否介导其细胞效应，仍需进一步的拯救实验和体内验证。
褪黑素–chi-miR-27a-3p–Wnt7B调控轴在内蒙古绒山羊真皮乳头细胞增殖中的作用
一、研究背景与科学问题
内蒙古绒山羊是我国北方重要的经济畜牧品种，以优质羊绒生产著称，其羊绒纤维平均直径小于15 μm，纤维长度约4–8 cm。羊绒产量与次级毛囊的生长发育密切相关，因此阐明次级毛囊发育的分子机制对于理解羊绒生长和提升羊绒产量具有重要意义。褪黑素（melatonin，MT）是主要由哺乳动物松果体分泌的激素，是昼夜节律和季节性生理过程的重要调控因子。已有研究表明，外源褪黑素植入可促进内蒙古绒山羊羊绒生长，但褪黑素信号与毛囊发育调控之间的分子机制尚不完全清楚。
MicroRNA（miRNA）是一类长约18–25个核苷酸的小型非编码RNA，主要通过mRNA降解或翻译抑制调控基因表达。越来越多的证据表明miRNA参与毛囊发育和周期转换的时序调控。研究人员前期通过褪黑素植入前后内蒙古绒山羊皮肤miRNA测序，鉴定出差异表达miRNA及其 putative 靶基因网络，其中包含chi-miR-27a-3p与Wnt7B。前期功能实验已证实褪黑素通过chi-let-7d-5p/WNT2轴促进真皮乳头细胞（dermal papilla cell，DPC）增殖，但chi-miR-27a-3p是否直接调控Wnt7B并参与褪黑素相关毛囊发育仍不清楚。Wnt7B是Wnt/β-catenin信号通路的重要组分，参与毛囊发育、干细胞稳态和毛囊周期调控。因此，本研究旨在表征chi-miR-27a-3p的功能，并探讨其与Wnt7B的潜在调控关系，为理解季节性羊绒生长的分子机制提供新见解。
二、主要技术方法
研究人员从3只一岁龄雄性内蒙古绒山羊（5月采集，即羊绒生长期anagen阶段）肩胛部皮肤分离DPC，不同动物来源的细胞分别培养。采用慢病毒载体构建chi-miR-27a-3p敲低（sh-chi-miR-27a-3p）和过表达（OE-chi-miR-27a-3p）模型；通过CCK-8实验和Ki67免疫荧光评估细胞增殖；流式细胞术分析细胞周期分布和凋亡；双荧光素酶报告基因实验验证chi-miR-27a-3p与Wnt7B 3′-UTR的直接相互作用；qRT-PCR和Western blotting检测Wnt通路相关基因表达。褪黑素处理浓度为300 pg/mL，处理4天。
三、研究结果
3.1 chi-miR-27a-3p敲低和过表达模型的构建与验证
通过免疫荧光染色检测DPC标志物α-SMA和VIM，确认培养细胞具有真皮乳头细胞特征。成功构建敲低和过表达慢病毒载体并转染至第3代DPC，48 h后转染效率超过80%，用于后续功能实验。
3.2 chi-miR-27a-3p抑制真皮乳头细胞增殖
CCK-8实验显示，与阴性对照（NC）组相比，chi-miR-27a-3p过表达显著降低细胞增殖（p < 0.01），而敲低则显著增加增殖活性（p < 0.01）。Ki67免疫荧光结果显示，过表达组Ki67荧光强度显著降低，但敲低组Ki67荧光强度无显著变化。
3.3 chi-miR-27a-3p影响细胞周期进程和凋亡
流式细胞术分析显示，chi-miR-27a-3p过表达显著增加G0/G1期细胞比例并减少G2/M期比例，而敲低则相反。凋亡分析表明，过表达显著增加凋亡细胞比例（p < 0.05），敲低显著减少凋亡（p < 0.05）。
3.4 Wnt7B是chi-miR-27a-3p的直接靶基因
双荧光素酶报告实验表明，chi-miR-27a-3p与Wnt7B-3′-UTR野生型（WT）报告载体共转染显著降低荧光素酶活性（p < 0.01），而突变预测结合位点后该抑制作用消失，证明chi-miR-27a-3p以序列依赖性方式直接靶向Wnt7B 3′-UTR。
3.5 chi-miR-27a-3p与Wnt/β-catenin相关基因表达变化相关
qRT-PCR和Western blotting结果显示，褪黑素处理显著增加β-catenin和Wnt10b表达，降低Wnt信号抑制剂SFRP1和DKK1表达。chi-miR-27a-3p敲低产生类似褪黑素的表达模式，而过表达则产生相反效应。蛋白水平上，褪黑素处理和chi-miR-27a-3p敲低均显著增加Wnt7B、β-catenin和Wnt10b蛋白表达，过表达则显著降低这些蛋白水平。
四、讨论与结论
本研究提出一个潜在的褪黑素–miRNA–Wnt调控模型：褪黑素处理伴随chi-miR-27a-3p下调，降低的chi-miR-27a-3p水平可能解除对Wnt7B的转录后抑制，从而促进Wnt7B表达和Wnt/β-catenin相关信号变化，最终促进DPC增殖。该模型补充了前期关于褪黑素–Wnt10b轴的研究发现，提示褪黑素可能通过多个Wnt相关分子组分调控DPC功能。值得注意的是，研究存在一定局限性：Ki67荧光在敲低组无显著变化，提示增殖增强的证据在不同检测指标间不完全一致；且研究未进行拯救实验验证chi-miR-27a-3p是否为褪黑素诱导增殖所必需，也未验证Wnt7B是否功能性地介导chi-miR-27a-3p的细胞效应。因此，褪黑素–chi-miR-27a-3p–Wnt7B调控关系应被视为实验支持的潜在调控模型而非完整的线性因果通路。
结论：在内蒙古绒山羊培养真皮乳头细胞中，褪黑素处理伴随chi-miR-27a-3p下调；chi-miR-27a-3p操作负向调控DPC增殖、细胞周期进程和凋亡；chi-miR-27a-3p以序列依赖性方式直接靶向Wnt7B 3′-UTR；chi-miR-27a-3p操作伴随Wnt7B、Wnt10b、β-catenin、SFRP1和DKK1表达的协调变化。这些发现支持褪黑素、chi-miR-27a-3p与Wnt7B在DPC中存在潜在调控关系。然而，本研究未测试chi-miR-27a-3p是否为褪黑素诱导增殖所必需，也未验证Wnt7B是否功能性介导chi-miR-27a-3p的细胞效应；拯救实验（褪黑素+chi-miR-27a-3p恢复；Wnt7B过表达和敲低）及体内验证是得出通路级结论所必需的。因此，这些发现与毛囊周期和羊绒纤维生产的相关性仍有待验证，而非本研究的既定结论。
