《Bioelectrochemistry》：Near-infrared pre-irradiation is associated with a distinct transcriptional signature in rat gastric irreversible electroporation: an exploratory genome-wide analysis
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•在胃部不可逆电穿孔（IRE）之前施加808纳米的预脉冲：334个显著差异基因（DEGs） vs. 仅IRE（n = 3）。•无转录本或基因集合在NIRE与IRE的比较中达到FDR<0.05的标准：一项探索性研究。•64%的NIRE与IRE的差异基因集合减弱或逆转了IRE诱导的变
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在胃部不可逆电穿孔（IRE）之前施加808纳米的预脉冲：334个显著差异基因（DEGs） vs. 仅IRE（n = 3）。
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无转录本或基因集合在NIRE与IRE的比较中达到FDR<0.05的标准：一项探索性研究。
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64%的NIRE与IRE的差异基因集合减弱或逆转了IRE诱导的变化。
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仅未校正的趋势：金属硫蛋白水平升高，NRF2/ARE诱导效应在NIRE中缺失。
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没有热休克相关特征可以归因于光照步骤，这表明加热并非实验因素。
引言
不可逆电穿孔（IRE）可以在不产生热量的情况下杀死组织。高压、微秒级的脉冲会在质膜上形成永久性的纳米孔，破坏细胞的跨膜稳态，导致细胞凋亡或坏死。细胞外基质和血管结构在很大程度上得以保留[1]，[2]。这种非热选择性使得IRE在靠近神经、大血管和导管的位置具有优势，因为这些部位使用热能进行消融可能具有危险性。然而，疗效并不是随着剂量增加而稳步提升的。在大鼠胃部IRE实验中，caspase-3和TUNEL检测显示出一个双相反应：在中等场强下细胞主要发生凋亡，当场强增加时则转变为坏死[3]。因此，场强并不是一个精确的控制参数。更有效的手段是从生物学角度入手——通过提高组织的敏感性，使得固定剂量能够发挥最大的凋亡效应。
化学敏化剂试图实现这一目标，例如使用博莱霉素或顺铂进行电化学治疗，或者使用溶瘤剂，但这些方法都受到药代动力学的限制：药物在异质性基质中的扩散不均匀，容易产生脱靶毒性，并可能引发皮肤反应[4]，[5]，[6]。一种通过光传递的、无需药物的敏化剂可以避免这些问题。800–810纳米的近红外（NIR）光主要被线粒体内膜的细胞色素c氧化酶（复合物IV）吸收。在低能量密度（1–10 J/cm2）下，它能够促进ATP合成，从内质网释放Ca2+，并从heme-a?/Cu_B中心释放一氧化氮，并改变细胞膜电位——这些共同作用构成了光生物调节（PBM）[7]，[8]，[9]。其中最关键的效果是：在2–4 J/cm2的能量密度下，PBM会使质膜过度极化。生物物理学研究表明，这种极化作用会降低孔洞形成的电压阈值，并使孔洞大小分布更广[10]，[11]。因此，NIR光可以在脉冲施加前的几秒钟内均匀地激活组织，而无需添加任何试剂。
Jeon等人测试了这一想法[12]。他们在活体大鼠胃部中将808纳米光（3 J/cm2）与随后的IRE脉冲（250 V，100 μs，20次脉冲）结合起来使用。与单独使用IRE相比，NIRE使脉冲期间的阻抗变化增加了13.5 Ω（p<0.01），TUNEL阳性细胞核的数量增加了1.12倍（p<0.05），p21和Bcl-xL蛋白的水平分别增加了1.29倍和1.24倍。虽然表型变化明显，但其具体机制尚不清楚。有三个问题需要解答：哪些转录程序使得NIRE与IRE有所不同？为什么光照预脉冲会在场强不变的情况下增加凋亡？这种效应是否是NIR光特有的，还是仅仅是IRE损伤效应的放大结果？
我们预期会得到一个多组分的结果，而非单一基因的作用，并提出了三个预测：首先，KEAP1/NRF2轴在氧化应激下决定了上皮细胞的凋亡阈值，而PBM驱动的线粒体Ca2+和NO水平可能减弱NRF2的活性。因此，我们预测NRF2的解毒靶标（Nqo1、Nqo2和Ptgr1）的表达会受到影响，从而降低IRE需要跨越的阈值。其次，Jeon等人观察到p21蛋白的增加，但未发现其转录源；金属硫蛋白是一类对PBM响应的基因，它们会参与应激诱导的细胞命运决定。我们预测它们的表达变化可以解释这种表型差异。第三，单独使用IRE会引发以中性粒细胞为主的M1型免疫反应。我们预测NIRE与IRE之间的差异会表现为以M2型巨噬细胞（Cd163、Ptix3和Lcn2表达增高）为主的反应，这些巨噬细胞会清除凋亡碎片并完成死亡过程。用于验证这些预测的基因集合是在已知单基因结果后根据文献整理的，并非预先选定；因此这些集合水平的分析属于描述性分析（见第2.4节）。
为了验证这些预测，我们使用Affymetrix Rat Gene 2.0 ST芯片对大鼠胃组织进行了分析，对比了四种处理组（对照组、仅光照组、IRE组和NIRE组）。我们根据小样本微阵列的特点应用了差异表达分析方法和t检验标准[13]，[14]，并在Bioconductor limma软件中对数据进行了统计处理以获得调整后的p值[15]，[16]，接着使用amera算法对每个预测的基因表达变化进行了相关性校正[17]。随后，我们利用g:Profiler将基因集合映射到KEGG通路和GO生物过程术语上。由于所有处理组都使用了相同的对照组，我们还分析了在NIRE和IRE之间有差异的转录本，确定这些转录本是增强了、减弱了还是逆转了IRE单独引起的变化。由于样本量较小，且在多重检验校正后几乎没有转录本或基因集合的差异得以保留，因此这项分析具有探索性，主要用于提出假设，而非确定具体机制。
章节片段
动物模型与处理方法
动物处理、麻醉、开腹手术和具体处理方法均按照Jeon等人的描述[12]进行，并获得了KOREA-2019-0146和KOREA-2021-0017（韩国大学医学院）的批准；完整的手术方案和设备描述（包括LVI-LSR808–1000 808纳米激光器、BTX Tweezertrode 45–0487圆盘电极以及Laplace/Pennes非热场验证方法）已在相关文献中详细说明，此处不再重复。
基因表达变化（DEG）的幅度随着处理复杂性的增加而增加；只有对照组的数据在基因组范围内分析后仍然具有统计学意义
对每个比较组进行基因表达量的定量分析（图1；表1）明确了这种效应。IRE与对照组的比较产生了1175个DEGs（711个上调，464个下调），NIRE与对照组的比较产生了1365个DEGs（813个上调，552个下调），而NIRE与IRE之间的比较仅产生了334个DEGs（210个上调，124个下调），大约是前两种比较数量的四分之一。在更严格的|fold change|≥2.0标准下，NIRE与IRE之间的差异缩减到70个基因（45个上调，25个下调）。在所有三个比较组中，共有2223个独特的DEGs。
讨论
为什么在不变的电流剂量之前施加短暂的光脉冲会进一步促进胃组织的凋亡？Jeon等人证实了表型变化（脉冲期间的阻抗增加了13.5 Ω，TUNEL阳性细胞核增加了1.12倍，p21蛋白增加了1.29倍），但未解释其分子机制[12]。我们的全基因组比较提供了一组可能的解释，但并未揭示具体机制。NIR光预处理并未放大IRE引起的广泛基因表达变化。
结论
对大鼠胃组织的探索性全基因组分析发现，在IRE基础上添加3 J/cm2的NIR光脉冲会产生一组特定的转录变化。其中64%的变化是NIRE减弱或逆转了IRE引起的效应；只有7%的变化是IRE效应的放大结果。在这些变化中，有三个候选的转录程序，全部属于描述性变化，且没有一个在多重检验中得到验证。
CRediT作者贡献声明
Han Jo Jeon：负责撰写初稿和数据收集。Hong Bae Kim：负责撰写初稿、方法设计和概念构思。Hyuk Soon Choi：负责监督研究过程。Jae Min Lee：参与验证工作。Eun Sun Kim：参与验证工作。Bora Keum：参与验证工作。Yoon Tae Jeen：参与验证工作。Hoon Jai Chun：参与验证工作。
伦理声明
本研究方案已经获得了韩国大学医学院动物护理与使用委员会的批准（批准编号：KOREA-2019-0146，2019年12月16日；KOREA-2021-0017，2021年7月2日）。所有实验过程均符合机构和国家关于实验动物护理和使用的指南。
资助情况
本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）[资助编号：2022R1F1A1075102、2021R1I1A1A01057303]和韩国技术促进院（KOITA）通过科学技术信息部（MSIT）的K-HERO培养与支持项目（资助编号：2026-KOITA-KH2–17）的支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究结果的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢韩国大学医学院动物实验设施的工作人员和微阵列服务提供的技术支持。
Han Jo Jeon|Hong Bae Kim|Hyuk Soon Choi|Jae Min Lee|Eun Sun Kim|Bora Keum|Yoon Tae Jeen|Hoon Jai Chun
