基于16个STR标记的库斯塔奈马品种遗传多样性与群体结构分析

《Animals》：Genetic Diversity and Population Structure of the Kustanay Horse Breed Based on 16 STR Markers

　　

库斯塔奈马（Kustanay horse）是哈萨克斯坦培育的骑乘品种，其遗传多样性和分化程度研究尚不充分。研究人员利用包含12个ISAG核心标记的17位点panel中的16个常染色体STR位点，评估了遗传多样性和群体结构。在765匹基因分型马中，排除重复记录和近亲后保留703匹；X连锁LEX3位点被排除于群体分析之外。研究涵盖五个群体：注册库斯塔奈马（KST，n=32）、来自Qazaq Tulpary的库斯塔奈马（KT，n=36）、纯血马（TB，n=31）、库斯塔奈杂交马（CROSS，n=9）及无系谱来源马（UB，n=595）。各群体期望杂合度较高（HE=0.661–0.725）。总体FST为0.0088，AMOVA显示99.13%的分子变异归因于个体内变异。Puechmaille估计量支持K=2，而Evanno ΔK在K=4处出现峰值；两种方案均未揭示群体间的清晰分离。Nei遗传距离和PCoA结果与弱分化及注册库斯塔奈马与无系谱马之间的相似性一致。群体大小不等限制了结果解读，这些发现不能确定单个无系谱马的品种身份。研究结果为系谱记录和保护规划提供了信息。

库斯塔奈马（Kustanay horse）是哈萨克斯坦培育的首个专业化骑乘品种，1951年获正式认定，由当地哈萨克草原母马与顿河马（Don）、纯血马（Thoroughbred）、斯特列列茨卡亚马（Streletskaya）及阿斯特拉罕（卡尔梅克）马（Astrakhan (Kalmyk)）公马级进杂交后经长期选育而成。据2024年11月官方数据，该品种现存种群约250–280匹，面临严重灭绝风险。当前存在的问题是：大量被畜主认定为库斯塔奈马但缺乏官方系谱记录的个体，其真实品种归属不确定，妨碍了育种管理和品种遗传完整性保护；以往研究多集中于单一品系、样本量有限或针对其他家马品种，尚缺乏基于国际标准化ISAG 17个STR标记panel对当代库斯塔奈马种群的全面评估。为此，研究人员开展了本项研究，旨在基于16个常染色体STR位点（含12个ISAG核心标记）全面评估库斯塔奈马品种的遗传多样性、群体结构及遗传分化程度，并评价不同来源和系谱状态马群体的遗传结构。

研究人员用到的主要关键技术方法包括：于2021–2025年在哈萨克斯坦各地区种马场、商品农场和私人小农庄采集成年马匹毛囊样本（样本队列来源为哈萨克斯坦共和国多个地区，共765匹，经质量控制及近亲剔除后为703匹，16个常染色体位点）；采用商业"COrDIS Horse"试剂盒（含17个STR位点，即12个ISAG核心标记AHT4、AHT5、ASB2、ASB17、ASB23、HMS2、HMS3、HMS6、HMS7、HTG4、HTG10、VHL20及5个附加位点CA425、HMS1、HTG6、HTG7、LEX3）进行多重PCR扩增和毛细管电泳基因分型；使用MICRO-CHECKER、COLONY进行数据质量控制与近亲鉴定；采用GenAlEx、ADZE、hierfstat进行多样性参数（Na、Ne、I、HO、HE、uHE、F、等位基因丰富度Ar及私有等位基因丰富度PAr）和分化指标（FST、FIS、FIT、AMOVA、Nei遗传距离、Nm）计算；采用STRUCTURE、StructureSelector（ΔK及Puechmaille估计量）、CLUMPAK、DAPC及PCoA进行群体结构分析，并以10个均衡子样本评估样本量不等的影响。

研究结果如下：

3.1 数据质量控制：通过MICRO-CHECKER和多基因型比较，校正了5个HTG4基因型并剔除4对重复样本，进一步分析纳入761匹马；16个位点均未检出口吃峰或大等位基因丢失证据，仅UB群体HMS3位点检出无效等位基因信号（0.0230–0.0305），故保留HMS3。COLONY未检出重复基因型，仅在KT（3对）和UB（59对，95匹个体，40个家系）中发现概率≥0.95的全同胞对；剔除KT 3匹和UB 55匹后，最终数据集为703匹（UB 595、KT 36、KST 32、TB 31、CROSS 9）。Bonferroni校正后各位点在各群体均未偏离哈迪-温伯格平衡（HWE），显著连锁不平衡（LD）仅见于UB群体（120对位点中17对），更可能反映UB群体的异质性而非位点间物理连锁。排除LEX3后TB的F由0.029降至0.002，UB由0.014降至?0.010。

3.2 等位基因多样性与等位基因频率：16个STR位点共检出155个不同等位基因，每位点等位基因数从2（CROSS群体HTG7）到16（UB群体ASB17）不等；多态性最高的位点为ASB17、HTG10、ASB2、ASB23和CA425，最低为HTG7。UB群体等位基因多样性最广，而KST、KT和TB等有系谱记录的群体等位基因较少；多数稀有等位基因频率低于5%，少数常见等位基因占据各 locus 等位基因谱的大部分。尽管等位基因数存在差异，最常见等位基因的分布在所有群体中相似（如AHT4位点等位基因157在五群体中四个为最常见，仅CROSS以149为主；HMS2、CA425和HMS3位点最常见等位基因分别为222、238和148）。UB群体表现出更多在其他群体中缺失或低频的稀有等位基因。

3.3 遗传多样性指数：观测等位基因数均值（Na）以UB最高（9.688±0.669），其余群体为4.250±0.296（CROSS）至6.438±0.387（KT）；经稀疏化至18个基因拷贝后，等位基因丰富度（Ar）为4.25（CROSS）至4.97（UB），群体间差异很小（KST 4.67、TB 4.54、KT 4.95），表明UB的高Na主要反映样本量而非更广的等位基因谱。私有等位基因丰富度在各群体均较低（每位点0.12–0.41），以KT（0.41）和UB（0.35）最高、TB（0.12）最低。有效等位基因数为3.260±0.263（CROSS）至3.974±0.314（UB），Shannon信息指数为1.244±0.077（CROSS）至1.530±0.070（UB）。各群体杂合度较高：HO为0.696±0.030（TB）至0.736±0.024（KT），HE为0.661±0.028（CROSS）至0.725±0.021（UB），uHE为0.700±0.030（CROSS）至0.725±0.021（UB）；固定指数接近零或为负（?0.099至0.002），未见明显杂合子缺失。

3.4 群体间遗传分化：位点特异性FST为?0.001（HMS3）至0.043（HTG4），8个位点分化显著（p<0.05），Bonferroni校正后AHT4和HTG4仍显著。跨位点总体分化低但显著（FST=0.0088，95% CI 0.0051–0.0142；p=0.001），群体内无杂合子缺失（FIS=?0.0095；p=0.921）。由总体FST估算的每代迁移数Nm=28.1（95% CI 17.4–48.6）。AMOVA显示0.87%的总变异归因于群体间差异，99.13%归因于个体内变异。配对FST为0.0017（KST–UB）至0.0463（CROSS–KT）；Bonferroni校正后KT–TB、CROSS–KT、TB–UB和CROSS–UB配对分化显著，KST–UB和CROSS–TB的95% CI包含零。10个均衡子样本中总体FST为0.0120–0.0157（均值0.0136），95% CI均不含零，略高于全数据集但依然很低，表明分化低但统计学显著且不依赖样本量不等。

3.5 群体遗传结构：LnP(K)从K=1至K=10单调上升未达平台；四个Puechmaille估计量均指示K=2，而ΔK在K=4处最高（ΔK=47.9），K=7（19.4）和K=6（16.2）处有较小峰值。各K值下个体隶属系数高度混合：K=2时第一聚类平均比例在CROSS为0.72、TB为0.67、KST为0.59、UB为0.51、KT为0.43，仅KT第二聚类超过0.5阈值（0.57），仅14.9%个体对某一聚类隶属系数≥0.8；K=3–5时UB的平均隶属接近1/K，无群体形成独立聚类。含LEX3时ΔK在K=2处最高（94.0），排除后该峰消失（ΔK=0.9–2.0），最高ΔK移至K=4；任何数据集中识别的聚类均不与预定义群体对应。10个均衡子样本中Puechmaille估计量均指示K=2，K=2时群体平均隶属与全数据集接近，但最大ΔK在各子样本间不同（K=2两次、K=3五次、K=4三次），等化群体大小未揭示额外结构。DAPC中BIC随K增加从1235.9（K=1）渐降至1194.9（K=9），K=5后差异小于6个单位且无清晰拐点；diffNgroup指示K=2，但两聚类与预定义群体不对应（KST个体等分16和16，UB个体比例为266和329）。预定义群体DAPC留一法交叉验证在等先验概率下正确分配率为CROSS 33.3%、KST 40.6%、KT 50.0%、TB 45.2%、UB 52.8%；按群体大小比例设先验时UB正确分配率达92.8%，但小群体多数个体被分配至UB（正确率3.1–33.3%）。个体分配检验正确分配240/703匹（34.1%）：CROSS 55.6%、KST 40.6%、KT 50.0%、TB 38.7%、UB 32.3%；UB个体分布于所有群体（136至KST、109至KT、143至TB）。个体水平PCoA前两轴分别解释4.8%和4.2%的变异（三轴12.9%），各群体95%椭圆几乎完全重叠，仅TB略向第一轴负值方向偏移。配对Nei遗传距离均较低（0.024–0.201）：最小为KST–UB（0.024），其次KT–UB（0.040）和TB–UB（0.043），KST–KT（0.061）和KST–TB（0.057）亦较小；最大为CROSS–KT（0.201），CROSS与其他群体距离（0.093–0.201）较高，但需考虑其样本量小（n=9）。PCoA与Nei遗传距离及STRUCTURE结果一致：各群体未形成清晰独立聚类，分布显著重叠，KST与UB位置接近，沿第一坐标（64.5%变异）CROSS和KT处极端位置，KST与UB居中央且彼此靠近，TB居中间位置并沿第二坐标（20.3%）偏移。总体而言，STRUCTURE、DAPC、分配检验、个体水平PCoA和Nei遗传距离一致显示低分化，无方法将研究群体识别为独立遗传聚类，与AMOVA结果相符。

讨论部分总结：高等位基因多态性证实含12个ISAG核心标记的17位点STR panel适用于库斯塔奈马遗传多样性评估，结果与既往库斯塔奈马研究一致并大幅扩展了信息量。UB群体等位基因数最多但稀疏化后等位基因丰富度与KT几乎相等，说明其等位基因数多主要源于样本量。杂合度值与既往研究和其他马品种范围相当。固定指数接近零或为负，原始分析中TB和UB的轻微杂合子缺失与X连锁LEX3位点有关（雄性半合子被记录为表观纯合子可人为抬高杂合子缺失估计），排除后F下降；多重比较校正后无HWE偏离及低无效等位基因频率表明最终数据集无因近交导致的杂合子缺失且基因分型可靠。多位点FST按Wright分类指示群体间弱分化，均衡子样本中略高但仍低；Nm估计与低分化一致但依赖岛屿模型假设，不能作为当代基因流或随机交配的独立证据，观察到的分化可能反映历史基因交流及群体近期共同起源，加之样本量差异和UB群体可能的异质性，现有数据无法就当前基因流强度作出确定结论。AMOVA支持同一格局。这些发现与家马既往研究一致，但STR基因分型需考虑同塑性（homoplasy），低FST不能作为群体遗传同质性的决定性证据，更准确的遗传结构评估需高密度SNP芯片。低分化也可能反映品种形成历史：库斯塔奈马由当地哈萨克母马与多个奠基品种公马长期杂交后经相对互联的育种群体长期选择而成，种公马在农场间交换及有影响力父系的重复使用可能维持了共享遗传背景并限制了强分化亚群的形成。两种K选择方法结果不同（Puechmaille估计量K=2，ΔK K=4），但均不与预定义群体对应；弱分化和不均等样本量下ΔK易产生虚假峰值且无法评估K=1，而Puechmaille估计量对样本量不等更稳健；本数据中Puechmaille解仅表现为动物对识别聚类的适度隶属且LnP(K)未达平台，半数均衡子样本中K=2的LnP低于K=1，加之DAPC无清晰BIC最小值和GenAlEx分配准确率低，表明研究群体未形成独立遗传聚类。Nei遗传距离与群体间紧密遗传关系一致，KST与UB距离最小，KT和TB与UB同样接近；PCoA中KST与UB位置接近，CROSS位置因样本量小需谨慎解读。KST与UB群体水平的小遗传距离表明其遗传相似性，但不能确认UB个体属于库斯塔奈品种；个体分配总准确率34.1%表明所用标记区分研究群体的能力有限，分子遗传数据应与可靠系谱记录结合解读。总体而言，FST、AMOVA、STRUCTURE、DAPC、分配检验、Nei遗传距离和PCoA的互补结果一致表明研究群体间存在显著遗传多样性伴弱分化，多种独立分析方法的一致性强化了研究群体共享 largely 共同遗传背景同时保留与育种历史相关某些差异的结论；优势等位基因分布的一致性提示研究群体间存在共享遗传背景。研究局限性包括群体样本量差异大（尤其UB群体n=595）及CROSS群体仅9匹，后者降低了无效等位基因和HWE检验效力，其亲缘关系和等位基因频率估计基于极少数个体，结果需谨慎解读；尽管如此，大总体数据集和多种互补方法结果的一致性提供了当代库斯塔奈马基因库稳健的群体水平特征。未来研究应增加有系谱记录的库斯塔奈马数量，并以高密度SNP基因分型补充STR分析，整合分子数据与详细系谱信息及线粒体DNA可进一步改善有效群体大小、祖先和近交估计。结论部分翻译：本研究是迄今为止基于765匹动物17位点STR panel（含12个ISAG核心标记）基因分型（质量控制后703匹、16个常染色体位点）对库斯塔奈马品种遗传多样性和群体结构最全面的分析。所有研究群体均发现与其他马品种相当的高水平遗传多样性，但仅杂合度值不足以得出库斯塔奈品种全部遗传潜力得到保存的结论。综合遗传多样性指数、FST、AMOVA、Nei遗传距离、贝叶斯聚类（STRUCTURE）和PCoA的分析仅揭示弱遗传分化，表明研究群体间 largely 共享遗传背景。高Nm值与低遗传分化一致，但不能就研究群体间历史或当代基因流强度作出明确结论。最大遗传相似性见于注册库斯塔奈马（KST）与UB群体之间，但由于多数奠基品种未纳入研究，不能排除该相似性反映哈萨克马更广泛遗传背景的可能。因此，结果刻画了群体水平的遗传关系，但不能确认单个UB动物属于库斯塔奈品种；个体分配准确率有限，凸显了将分子遗传数据与可靠系谱信息结合的必要性。结果支持ISAG STR标记panel除已确立的个体识别和亲子鉴定用途外，也适用于库斯塔奈马遗传多样性评估。所获数据大幅扩展了对库斯塔奈马品种遗传结构的认识，为后续研究奠定基础；将其实际应用于澄清个体动物来源和系谱登记，需开展纳入奠基品种和其他遗传近缘群体并结合分子遗传数据与可靠系谱记录的综合分析。