《Animals》：Comparative Analysis of Mare Milk and Foal Faecal Microbiota in Kyrgyz Mare–Foal Pairs During the First 21 Days Postpartum
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本研究采用V3–V4 16S rRNA基因测序技术，对8对吉尔吉斯母马-马驹配对在分娩时（0 h）、产后24 h及第7、14、21天采集的40份乳样和39份粪样进行细菌DNA谱表征。采用置换Friedman检验检测马驹粪便Shannon多样性和观察特征数的时序
本研究采用V3–V4 16S rRNA基因测序技术，对8对吉尔吉斯母马-马驹配对在分娩时（0 h）、产后24 h及第7、14、21天采集的40份乳样和39份粪样进行细菌DNA谱表征。采用置换Friedman检验检测马驹粪便Shannon多样性和观察特征数的时序差异（Holm校正p均为0.020），但乳样未检测到显著时序差异。粪便多样性在24 h和第7天描述性低于出生时，第14–21天回升。动物区组加权UniFrac PERMANOVA检测到粪便DNA谱的时序效应（Holm校正p = 0.0028），乳样则未检测到（p = 0.0956）。配对区组乳-粪比较在各时间点均显著（Holm校正p = 0.0391），但离散度差异限制了解释。由于缺乏测序阴性对照，无法区分背景污染与真实乳相关细菌DNA，因此乳样谱不能确信归因于常驻乳微生物群。观察到的分类学相似性不能证明微生物传播或乳源性马驹肠道定植。粪便显著而乳样不显著不能确立两者时序响应存在差异，因未进行直接交互检验。上述发现属探索性，需受控验证。
研究背景：母马的上皮绒毛膜胎盘阻止母体抗体产前转移至马驹，导致新生马驹出生时处于生理性低丙种球蛋白血症状态，其有效免疫应答约需两周才能建立，此期间马驹极易感染，故出生后及时摄入初乳至关重要。初乳富含免疫球蛋白、蛋白质、维生素、矿物质、抗菌肽、乳铁蛋白、生长因子、溶菌酶和激素等生物活性物质。马场常用Brix折射仪（BRM）评估初乳质量并依据免疫球蛋白G（IgG）含量分级，被动免疫转移失败（FPT）在马驹中患病率为3%–37.8%。已有纵向研究记录了马驹粪便微生物群随年龄的变化，但母马乳与马驹肠道细菌谱的直接比较研究有限。Mienaltowski等对15对母马-马驹产后15天的随访发现乳与马驹直肠拭子群落分化增加，提示乳以外来源对早期肠道微生物发育有重要贡献。本研究在此基础上，对吉尔吉斯队列配对母马乳和马驹粪便细菌DNA谱进行探索性描述，涵盖出生时（0 h）至产后第21天，旨在表征母马初乳和乳样在0 h、24 h及第7、14、21天的细菌DNA谱，并评估同窝马驹粪便微生物组成在相同时间点的变化。
主要技术方法：研究在私营马匹繁育寄养设施进行，纳入8匹健康吉尔吉斯品种成年孕马（平均6岁，体重约300–350 kg）及其所产8匹母驹（出生重约25–30 kg，均由同一公马配种），排除患全身性疾病、腹泻、子宫炎、乳腺炎或需药物治疗者及难产者。母马按初乳Brix读数分为初乳质量良好组（>20%，Group 1，n = 4）和初乳质量不足组（<20%，Group 2，n = 4）。于5个时间点采集乳样和粪样，共79份样本（乳40份、粪39份；F2_2未采集）。乳样经70%酒精消毒乳头、弃去初流后无菌采集约2 mL；粪样直接从马驹直肠无菌采集；样品立即于?80 °C保存。基因组DNA分别采用Milk Bacterial DNA Isolation Kit和DiaRex Stool Genomic DNA Extraction Kit提取。扩增细菌16S rRNA基因V3–V4高变区（引物341F和806R），在Illumina MiSeq平台进行2 × 250 bp双端测序。序列经FastQC评估质量，QIIME 2处理，DADA2进行质量过滤、去噪、双端合并和嵌合体去除以推断扩增子序列变体（ASV），SILVA 138数据库进行分类学注释。未设置提取空白和無模板PCR对照，未对阴性对照样本测序。同时于各时间点采集马驹颈静脉血和母马乳样，用物种特异性商品化酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒测定IgG浓度（mg/mL）。统计分析采用自定义Python 3.0脚本：α多样性以Shannon多样性（log2）和观察特征数评估（抽平深度2000条序列）；时序差异用置换Friedman检验（9999次动物内置换，含7匹母马和7匹马驹完整观测）；β多样性用加权UniFrac距离矩阵，以PERMANOVA检验时序效应（控制动物身份，9999次动物内限制置换）；乳-粪比较按时间点纳入完整配对，控制配对身份；多重比较采用Holm校正；多变量离散度以偏差校正距离评估。
研究结果：
3.1 母马乳微生物群：乳样细菌DNA家族水平分类谱显示，母马M2各时间点均检测到Lachnospiraceae、Prevotellaceae和Streptococcaceae，后期时间点还包括Lactobacillaceae。样本M5_3中Pseudomonadaceae占输出家族水平分类表读数的79.6%。多个乳样含较大比例家族水平未解析序列和细胞器相关序列。Corynebacteriaceae在全部40份乳样中检出（平均相对丰度1.73%，M2_3最高7.32%）。属水平主要分类包括Pseudomonas（4.01%）、Streptococcus（3.35%）、Vibrio（2.11%）、Gemella（2.09%）和Corynebacterium（1.72%），属水平未解析序列平均占31.97%。这些分类谱代表所分析乳样中检出的细菌DNA而非确认的常驻乳相关微生物群落，因无测序阴性对照，背景污染贡献无法确定。Shannon多样性（Friedman Q = 0.914）和观察特征数（Q = 0.571；Holm校正p均为1.000）均未检测到显著时序差异；观察特征数稀释曲线在最大评估深度2000条序列处仍持续上升未达平台。基于Bray–Curtis相异度的主坐标分析（PCoA）前两轴分别解释15.38%和11.35%变异，各时间点样本重叠无明显时间分组。加权UniFrac距离分析控制个体身份后未检测到显著时序效应（PERMANOVA，pseudo-F = 1.318，R2 = 0.096，Holm校正p = 0.0956），多变量离散度亦无显著时序差异（F = 0.493，Holm校正p = 0.4663）。
3.2 马驹粪便微生物群：马驹粪便细菌群落谱在产后21天5个时间点间变化。早期采样期以Enterobacteriaceae、Bacillaceae和Streptococcaceae为显著家族；F1_2和F6_1中Enterobacteriaceae相对丰度超60%（分别为62.2%和61.8%）；24 h时F1_2和F4_2中Clostridiaceae分别达22.3%和19.7%，同时其他马驹显示Lachnospiraceae、Bacteroidaceae和Akkermansiaceae相当比例；第7天Lactobacillaceae、Akkermansiaceae和Bacteroidaceae在个别样本中分别达46.6%、36.7%和31.3%；第14和21天以Lachnospiraceae、Oscillospiraceae、Christensenellaceae、Rikenellaceae、Prevotellaceae和Akkermansiaceae为显著家族。属水平主要分类包括Escherichia–Shigella（10.33%）、Akkermansia（7.24%）和Bacteroides（7.08%），属水平未解析序列平均占17.13%。完整病例置换分析检测到粪便Shannon多样性（Friedman Q = 13.257，Holm校正p = 0.020）和观察特征数（Q = 12.914，Holm校正p = 0.020）的时序差异，中位数在24 h和第7天描述性低于出生时、第14–21天回升；综合检验表明整体时序差异但未识别具体时间点差异。PCoA前两轴分别解释16.55%和9.72%变异。加权UniFrac距离分析控制个体身份后检测到粪便群落组成的时序效应（PERMANOVA，pseudo-F = 2.271，R2 = 0.218，Holm校正p = 0.0028），多变量离散度无显著时序差异（F = 1.924，Holm校正p = 0.1428）。
3.3 母马乳-马驹粪便微生物群：Bray–Curtis PCoA用于可视化各采样时间乳与粪细菌DNA谱差异。基于加权UniFrac距离的配对区组PERMANOVA在全部5个采样时间检测到样本类型间差异（Holm校正p均为0.0391），但各时间点多变量离散度亦存在差异（Holm校正p = 0.0195–0.0313），乳样离散度更大，故显著PERMANOVA结果不能完全归因于多变量位置差异。乳与粪细菌DNA谱间观察到分类学重叠：两者均检出Firmicutes和Bacteroidota，共享家族水平分类在多个采样时间包括Lachnospiraceae、Streptococcaceae和Prevotellaceae。但因无测序阴性对照，背景污染对乳谱的贡献无法确定，故这些相似性仅代表检出细菌DNA序列间的描述性重叠，不能确立微生物传播、乳源性肠道定植或两样本类型间直接生物学关系；各时间点比较和排序分析均未证明时序趋同。
3.4 马驹血清与母马乳免疫球蛋白G浓度：基于Brix值的Group 1（>20%）检测到较高初乳IgG浓度，但两组初乳IgG浓度在产后24 h后均迅速下降并随后维持低水平；两组母马乳IgG浓度在产后24 h后均快速下降。马驹摄入高IgG浓度初乳导致24 h龄血清IgG水平显著较高，该组间差异在整个产后期持续存在。两组马驹血清IgG浓度在0 h均极低，24 h起显著升高并在21天期间维持升高，但接受较低IgG浓度初乳的Group 2马驹在整个21天期间血清IgG水平持续低于Group 1马驹。
讨论部分总结：本研究检测到马驹粪便α多样性和加权UniFrac谱的显著时序差异，而乳样相应检验未达统计学显著；但上述结果来自独立分析，未检验样本类型×时间直接交互作用，故不能证明两样本类型时序响应存在显著差异；乳样无统计学显著性不应解释为时序稳定性证据，尤其鉴于样本量小和乳相关细菌DNA生物学来源不确定。乳-粪比较各时间点显著但多变量离散度差异限制解释，结果应视为探索性。与Mienaltowski等研究相比，本研究的乳谱包含Lachnospiraceae、Prevotellaceae和Bacteroidaceae等显著肠道相关家族，这些差异不能仅归因于群体间生物学变异，采样程序、提取方法、目标区域和生物信息学处理均可能有贡献，而无阴性对照使污染问题未解决；多样性直接数值比较亦需谨慎（本研究用观察特征数而非Chao1，Shannon值用log2需统一对数底数后才能比较）。乳样无显著时序效应不能确立稳定性、等效性或生态韧性；仅8匹母马中7匹提供完整α多样性序列，适度变化可能未被检出；Firmicutes、Bacteroidota、Lachnospiraceae、Prevotellaceae和Streptococcaceae的重复检出不能确立保守的常驻乳微生物群。M5_3中Pseudomonadaceae占79.6%需特别谨慎：Li等报道水鹿乳中丰度Pseudomonas，Salter等将Pseudomonas列为试剂相关污染物并证明低生物量谱对背景DNA的脆弱性，Scully等在表征加工牛初乳时纳入阴性对照和计算污染物去除而本研究未纳入；无提取空白、無模板PCR对照或环境样本，M5_3谱无法区分生物学变异与采集或处理污染，高相对丰度亦不能证明绝对细菌载量增加。乳观察特征数稀释曲线在2000条序列处持续上升，该深度未提供完整 richness 采样证据；主图"Other"类别合并低丰度已分配分类、家族水平未解析序列和细胞器相关序列，其大小既反映分组规则也反映分类分辨率，不能独立证明生态复杂性、测序充分性或样本质量差。马驹粪便谱时序变化与早期马肠道微生物组成随年龄变化的广泛证据一致，Enterobacteriaceae、Bacillaceae和Streptococcaceae早期占优而Lachnospiraceae、Oscillospiraceae、Christensenellaceae、Rikenellaceae、Prevotellaceae和Bacteroidaceae后期更显著，与De La Torre等描述的从早期变形菌门主导向含更多厚壁菌门群落的转变相似，但家族水平相对丰度谱不能确立代谢活性或肠道氧可利用性变化；因未做差异丰度分析，观察到的分类学变化应描述性解释而非统计证明的个别家族富集。马驹α多样性未自出生起逐步升高，0 h中位Shannon多样性和观察特征数高于24 h和第7天、14–21天回升；综合检验支持整体时序差异但未识别特定时间点对比；0 h相对高多样性值需谨慎因细菌生物量未定量、最早样本对背景DNA的易感性未解决，背景DNA可不成比例影响低生物量谱，故0 h结果不能假定代表高度多样已建立的肠道群落或产前定植证据。乳与粪共享Lachnospiraceae、Streptococcaceae和Prevotellaceae等家族，但此重叠不能识别其来源或转移方向；独立时间点比较和独立计算排序分析均未确立配对乳与粪谱间时序趋同，故马驹粪便谱内变化须与乳-粪相似性变化区分。Mady等考察母马乳代谢物与马驹肠道微生物群关联，属营养关系而非证明经乳细菌传播；人类中Ferretti等用纵向菌株解析宏基因组学研究母婴体表微生物传播，虽不能直接外推至马，但说明共享家族水平分类之外所需的分辨率和来源采样。母马粪样是发育中马驹肠道微生物的另一潜在来源：Pyles等检测到产后第3天起食粪行为并与第7天马驹粪样可培养纤维素分解菌正相关，支持食粪在早期微生物建立中的潜在作用，但因未采集母马粪便微生物群，其潜在贡献无法评估或与乳相关及其他环境来源区分。局限性包括：小队列和21天随访限制推广性和后期持续性评估；引物选择影响16S rRNA基因调查的分类覆盖；部分16S rRNA基因序列可能分辨率不足以区分近缘种或株，ASV不应解释为种或株的直接等同物；相对序列丰度不量化细菌载量，DNA检出不确立活力；缺乏测序提取空白和無模板PCR对照是主要局限，尤其对乳和出生时可能低生物量样本，无这些对照或细菌生物量测定，背景DNA对观察谱的贡献无法可靠评估，乳发现仍属探索性且生物学和技术贡献未解决；缺乏母马粪便、乳头皮肤和环境样本进一步限制来源归因；统计再分析依赖输出多样性值和距离矩阵，无法独立验证细菌特征过滤和原始β多样性抽平深度；完整病例α多样性检验降低样本量，限制置换假设动物内可交换性而未明确建模序列自相关；未对个别饲料成分和完整日粮进行实验室营养分析，缺乏粗蛋白、粗纤维、灰分、NDF、ADF等营养参数分析数据，无法详细评估日粮组成，故解释结果时不能完全排除未测营养和动物相关因素的潜在影响。未来需更大规模队列、更长随访、细菌载量测定、测序阴性对照和菌株解析来源比较以研究乳相关细菌是否贡献马驹肠道定植。
研究结论翻译：本探索性初步研究表征了8对吉尔吉斯母马-马驹产后21天内母马乳和马驹粪便样本中的细菌DNA谱。在马驹粪便多样性和加权UniFrac谱中检测到显著时序差异，而乳样相应分析未达统计学显著。但因未进行直接交互检验，这些独立发现不能确立样本类型间时序响应差异。乳-粪比较亦产生显著结果，但多变量离散度差异限制了解释。共享分类学分配不能证明微生物传播或乳源性肠道定植。此外，缺乏测序阴性对照使真实乳相关细菌DNA与潜在背景污染无法可靠区分。鉴于上述局限和小队列，发现应解释为需在更大规模、适当受控的纵向研究中验证的探索性观察。
