天冬氨酸抑制mTORC1激酶活性并削弱HIV-1前病毒再激活：细胞通透性天冬氨酸类似物的潜伏调控作用

《Journal of Virology》：Aspartate inhibits mTORC1 activity and impairs reactivation of HIV-1 provirus

　　

mTORC1复合体响应包括氨基酸在内的多种营养物调节细胞生长。研究人员证明，与所有其他氨基酸不同，天冬氨酸（aspartate）抑制mTORC1激酶活性。一项shRNA筛选显示，多个与天冬氨酸代谢相关的基因调节HIV-1前病毒表达。基于这一观察，研究人员发现，细胞通透性天冬氨酸类似物天冬氨酸二甲酯（ADE）和天冬氨酸二叔丁基酯（ADTB）抑制T细胞中潜伏HIV-1表达的再激活，并抑制mTORC1信号转导。在过表达天冬氨酸转运体EAAT1的Jurkat或HEK293细胞中，向培养基加入过量天冬氨酸也抑制mTORC1。研究人员发现天冬氨酸在体外直接抑制mTORC1激酶活性。这些观察表明，过量天冬氨酸抑制mTORC1信号转导；研究人员提出，细胞内天冬氨酸水平作为传感器调节合成代谢。此外，这些结果提示，对细胞内天冬氨酸浓度进行治疗性调控可能为调节HIV-1前病毒表达提供新手段。

研究背景与问题：HIV-1前病毒（provirus）从5′ LTR起始的表达与T细胞激活状态紧密偶联，受T细胞受体下游RAS-MAPK/ERK、PKC-IKK和钙-钙调磷酸酶等通路控制，并受JAK-STAT、PI3K-AKT、Wnt/β-catenin、NOTCH和mTOR（mechanistic target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白）等信号调节；其中JAK-STAT、PI3K-AKT或mTOR信号增强可促进HIV-1 LTR表达，而Wnt/β-catenin和NOTCH抑制启动子表达。围绕清除或永久沉默潜伏前病毒库，研究者已开发潜伏逆转剂（latency-reversing agents，LRAs）和潜伏促进剂（latency-promoting agents，LPAs），但已鉴定的LPAs数量有限，且尚无进入试验者。为从已知生化活性化合物中寻找潜在新型LRAs和LPAs，研究人员利用针对约1,200个已知药物靶基因的shRNA（short hairpin RNA，短发夹RNA）文库，在携带微型双报告HIV-1病毒（mini-dual HIV-1 reporter virus，mdHIV）的三株T细胞系中进行筛选；由此观察到天冬氨酸代谢可能影响前病毒再激活，并进一步检验天冬氨酸及其细胞通透性类似物是否通过mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1，雷帕霉素靶蛋白复合体1）调节HIV-1潜伏。研究结论提示，过量天冬氨酸抑制mTORC1信号，细胞内天冬氨酸水平可作为合成代谢传感器；治疗性调控细胞内天冬氨酸浓度可能成为调节HIV-1前病毒表达的新策略。

关键技术与方法：研究采用针对约1,200个已知药物靶基因的shRNA文库，在携带mdHIV报告病毒且整合位点不同的Jurkat-Tat克隆11、90和131中感染并FACS分选活跃、潜伏和关闭细胞群，结合shRNA二代测序与edgeR分析；构建过表达天冬氨酸转运体EAAT1（SLC1A3）的Jurkat和HEK293细胞；以免疫印迹检测p70 S6K1 T389和Akt S473磷酸化；以HA-Raptor免疫沉淀mTORC1复合体并进行GST-4E-BP1体外激酶反应；以流式细胞术检测dsRed报告表达，以RT-qPCR检测HIV-1多重剪接Tat-Rev mRNA、IL2和CD69并以GAPDH归一化；使用接受抗逆转录病毒治疗（ART）的HIV-1感染者外周血单个核细胞（PBMCs）来源的CD4⁺ T细胞进行再激活实验。

研究结果：
A screen for novel regulators of HIV-1 provirus reveals a role for aspartate metabolism（HIV-1前病毒新型调控因子筛选揭示天冬氨酸代谢作用）：通过已知药物文库shRNA筛选及活跃群与潜伏、关闭和未分选群比较，研究人员发现氨基酸代谢和转运相关基因，尤其是天冬氨酸相关节点；靶向ASPA（编码天冬氨酸酰化酶，将N-乙酰-L-天冬氨酸转化为天冬氨酸）及氨基酸转运基因SLC1A3、SLC12A1的shRNA影响三株报告细胞中的前病毒表达。
Cell-permeable aspartate analogs inhibit mTORC1 activity in Jurkat T cells（细胞通透性天冬氨酸类似物抑制Jurkat T细胞mTORC1活性）：在Jurkat T细胞中，ADE和ADTB呈剂量依赖性和时间依赖性抑制p70 S6K1 T389磷酸化，5 mM ADE和2.5 mM ADTB可达到与雷帕霉素相近的抑制程度；在HEK293细胞中亦观察到类似抑制，提示该效应不限于T细胞。
Elevated aspartate in the growth media inhibits mTORC1 signaling in cells expressing the aspartate transporter EAAT1（培养基中升高天冬氨酸抑制表达天冬氨酸转运体EAAT1细胞的mTORC1信号）：在过表达EAAT1的Jurkat和HEK293细胞中，外源过量天冬氨酸抑制p70 S6K1磷酸化，而空载体对照无此效应；天冬氨酸、ADE和ADTB不影响mTORC2底物Akt S473磷酸化，提示效应特异于mTORC1。
Aspartate and cell-permeable analogs inhibit mTORC1 activity in vitro（天冬氨酸及细胞通透性类似物体外抑制mTORC1活性）：利用HA-Raptor/mTOR复合体和GST-4E-BP1底物进行体外激酶反应，ADTB、天冬氨酸、ADE及Torin1降低4E-BP1 T37/T46磷酸化，谷氨酸或精氨酸无此作用；天冬氨酸呈浓度依赖性抑制，且对PKA和ERK1反应的检验支持该抑制对mTORC1具有相对特异性。
Aspartate analogs suppress HIV-1 reactivation in T cells（天冬氨酸类似物抑制T细胞中HIV-1再激活）：在三株mdHIV Jurkat细胞中，ADE或ADTB预处理2 h显著削弱PMA诱导的前病毒再激活；在接受ART的HIV-1感染者CD4⁺细胞中，雷帕霉素、ADE或ADTB预处理显著抑制PMA/ionomycin诱导的HIV-1 mRNA表达；ADE和ADTB还降低IL2表达，而CD69仅受雷帕霉素显著抑制；在抑制再激活的浓度下，ADE和ADTB未显著影响细胞活力，提示其作为LPAs的潜力。

讨论与结论：讨论指出，携带整合病毒基因组的潜伏感染细胞是HIV-1治愈的主要障碍，前病毒间歇表达可驱动ART中断后的病毒反弹，并维持潜伏库；“block and lock”策略旨在用LPAs将前病毒表达 irreversibly 抑制。既往研究已显示mTORC1信号参与HIV-1前病毒再激活，pp242、Torin1和雷帕霉素等mTOR抑制剂可抑制再激活，mTORC1抑制剂可降低CDK9（cyclin-dependent kinase 9，细胞周期蛋白依赖性激酶9）磷酸化，提示其影响P-TEFb（positive transcription elongation factor b，正性转录延伸因子b）介导的转录延伸。mTORC1受生长因子和氨基酸调控，亮氨酸、精氨酸和甲硫氨酸等通过RAG GTPases促进mTORC1定位于溶酶体；本研究中天冬氨酸及细胞通透性类似物则抑制mTORC1，且该效应在酵母与人类细胞间保守，并在体外直接抑制mTORC1激酶活性而不抑制mTORC2。天冬氨酸位于嘌呤、嘧啶和其他氨基酸生物合成通路交汇处，细胞内天冬氨酸浓度通常为2–10 mM，体外对4E-BP1磷酸化的IC₅₀约为5–10 mM，支持其作为合成代谢传感器调节mTORC1的假说。局限性在于天冬氨酸抑制mTORC1的确切机制尚不清楚，尚需未来研究确定其是直接抑制mTORC1激酶亚基，还是通过改变mTORC1复合体中相关蛋白相互作用而发挥作用。研究结论可译为：这些观察表明，过量天冬氨酸抑制mTORC1信号转导，研究人员提出细胞内天冬氨酸水平作为传感器调节合成代谢；此外，这些结果提示，对细胞内天冬氨酸浓度进行治疗性调控可能为调节HIV-1前病毒表达提供新手段。