RNA病毒感染诱导乳酸积累促进病毒复制的机制研究

《Microbiology Spectrum》：Lactate accumulation triggered by RNA virus infection facilitates viral replication

　　

作为糖酵解的终产物，乳酸已成为介导代谢重编程与免疫调节的关键信号分子。尽管已知RNA病毒会利用宿主代谢，但乳酸积累在病毒发病机制中的确切作用仍有待阐明。本研究以新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）和甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）为模型病原体，证明RNA病毒感染能迅速激活宿主糖酵解并诱导持续的乳酸积累，从而创造有利于病毒复制的微环境。药理学抑制糖酵解可显著抑制病毒增殖。在抑制-挽救实验中，外源性补充乳酸逆转了由糖酵解抑制引起的抗病毒免疫基因和IRF3磷酸化变化。在不抑制糖酵解的情况下添加外源性乳酸钠进一步抑制了抗病毒免疫基因表达和IRF3磷酸化。机制上，病毒诱导的乳酸积累与视黄酸诱导基因I样受体（retinoic acid-inducible gene I-like receptor, RLR）信号通路的抑制相关：过量的乳酸作用于干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3, IRF3）上游，其方式与抑制线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling protein, MAVS）-IRF3轴一致，从而减弱I型干扰素产生。综上，这些发现定义了一个正反馈环路，其中RNA病毒利用宿主代谢重编程积累乳酸，进而抑制抗病毒先天免疫并促进病毒复制。

论文解读文章

研究背景与科学问题

长期以来，乳酸被视为糖酵解的代谢“废物”。然而近年研究彻底改变了这一传统认知，揭示乳酸作为一种信号分子，在细胞能量代谢、免疫调节和表观遗传修饰中发挥关键作用。在生理条件下，细胞内乳酸的产生与细胞内外区室之间通过单羧酸转运蛋白维持动态平衡。但在病理状态下，尤其是病毒感染期间，宿主细胞代谢发生重编程，糖酵解速率显著上调，导致大量乳酸积累。作为专性胞内寄生物，病毒缺乏独立的代谢系统，高度依赖宿主细胞提供能量和大分子前体进行复制。越来越多的证据表明，多种RNA病毒能够主动重编程宿主细胞代谢，将葡萄糖代谢从氧化磷酸化转向有氧糖酵解。然而，一个核心问题仍未解决：乳酸积累仅仅是病毒诱导代谢失调的被动副产物，还是代表病毒获取复制优势的主动策略？本研究旨在系统阐明RNA病毒感染触发宿主细胞乳酸积累的时间动态及其生物学意义。

研究方法与技术路线

研究人员采用新城疫病毒（NDV）Herts/33株和甲型流感病毒（IAV）WSN株感染人非小细胞肺癌细胞系A549和人肝癌细胞系HepG2作为研究模型。关键技术包括：使用荧光葡萄糖类似物2-NBDG标记结合流式细胞术检测葡萄糖摄取；利用乳酸检测试剂盒测定细胞外乳酸浓度；应用Seahorse XFe96细胞外流量分析仪实时监测细胞外酸化率评估糖酵解通量；通过转录组数据分析结合RT-qPCR验证糖酵解及乳酸转运相关基因转录水平；采用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖联合外源乳酸钠进行抑制-挽救实验；运用Western blot检测IRF3磷酸化水平；通过荧光观察、TCID₅₀测定和噬斑试验评估病毒复制水平。转录组数据来源于公共数据库GEO（登录号GSE295522）。

研究结果

NDV和IAV感染促进宿主葡萄糖摄取、糖酵解及乳酸积累

研究发现，NDV和IAV感染A549细胞后，与未感染对照组相比，在感染后6、12、18和24小时均显著增加葡萄糖摄取。葡萄糖阳性细胞比例从对照组的约10%上升至NDV感染18小时的约27%和IAV感染18小时的约33%。两种感染均诱导显著的、时间依赖性的乳酸积累：NDV诱导的乳酸在感染后6小时即开始升高，在18-24小时达到约5倍于对照的水平；而IAV诱导更陡峭且持续的增加，至24小时达到约9倍。实时ECAR检测显示，在A549和HepG2细胞中，NDV和IAV感染均在6小时显著提高基础糖酵解速率、糖酵解能力和最大糖酵解能力，证实病毒诱导的糖酵解激活具有跨细胞类型的普遍性。

病毒感染上调糖酵解及乳酸转运相关基因转录水平

对公共转录组数据的差异基因聚类分析显示，NDV感染后葡萄糖代谢相关基因差异表达。RT-qPCR验证表明，NDV感染组中HK2、PDK1、LDHA、MCT1和HIF-1α的转录水平均显著上调，MCT4无显著变化。IAV感染组呈现高度一致的上调模式，且MCT4转录本也显著升高。MCT4主要介导高糖酵解状态下的细胞外乳酸转运，其在IAV感染中的选择性增加可能是IAV诱导乳酸积累程度高于NDV的重要分子基础。

抑制糖酵解显著减弱NDV和IAV复制

通过CCK-8法确定10mM 2-DG为最佳工作浓度后，研究人员发现2-DG处理显著降低NDV-GFP荧光强度、NDV-NP蛋白表达、子代病毒滴度和噬斑数量。在IAV模型中同样观察到IAV-NP蛋白表达显著降低、各时间点子代病毒滴度显著下降以及噬斑数量显著减少。结果表明NDV和IAV的复制均对2-DG处理敏感，支持宿主葡萄糖代谢对两种病毒高效复制的贡献。

乳酸抑制与RLR-MAVS-IRF3信号轴相关的抗病毒先天免疫应答

基于先前报道的乳酸可直接结合MAVS跨膜域阻碍其线粒体定位和聚集的机制，研究人员进行了抑制-挽救实验。在NDV模型中，2-DG阻断糖酵解显著增加了IFN-α、IFN-β、ISG15、MAVS和IL-6的转录，IAV模型呈现相同趋势，其中IFN-β效应最显著，而IRF3 mRNA保持稳定。在2-DG背景上添加外源乳酸逆转了这一去抑制作用，使免疫基因表达恢复至接近单独病毒感染水平。在不抑制糖酵解的情况下添加乳酸则进一步降低了IFN-β和MAVS的表达。IAV模型中MAVS的去抑制和挽救效应比NDV模型更明显，与IAV诱导更高内源性乳酸水平一致，表明乳酸积累程度与免疫抑制强度之间存在正相关关系。

乳酸抑制MAVS下游的IRF3磷酸化并减弱抗病毒先天免疫应答

由于IRF3 mRNA在各组间无差异，研究人员通过Western blot检测IRF3磷酸化水平。结果显示，在NDV模型中，2-DG+NDV组的p-IRF3显著高于NDV组；2-DG+NDV+Lac组p-IRF3回落至接近NDV单独感染水平；NDV+Lac组p-IRF3低于NDV单独感染组。IAV模型获得了一致的结果。这些数据表明，在蛋白磷酸化水平上，乳酸以一种与抑制MAVS-IRF3信号轴一致的方式抑制IRF3活化，减少IFN-I产生。

讨论与结论

本研究表明，NDV和IAV通过与HIF-1α驱动的转录上调相关联的方式激活糖酵解途径，增加的LDHA和MCT表达为增强乳酸产生和外排提供了转录基础。积累的乳酸通过作用于MAVS-IRF3轴减弱I型干扰素产生，形成免疫逃逸微环境。代谢重编程与免疫抑制共同构成支持病毒高效复制的正反馈环路。该模型为RNA病毒发病机制提供了新视角，并为基于乳酸代谢干预的广谱抗病毒策略奠定了基础。临床上，重症流感患者血乳酸升高已被报道，高乳酸血症与疾病严重程度和不良预后相关，但血乳酸作为抗病毒免疫状态特异性标志物的临床应用仍需直接验证。此外，本研究还观察到两种病毒模型间的种属特异性差异，这可能与它们不同的干扰素拮抗机制有关。未来研究应关注乳酸对其他先天免疫信号通路的影响、在适应性免疫中的作用以及不同组织器官的调控特异性。