建立靶向NS1基因的TaqMan探针实时PCR检测猪博卡病毒3群并鉴定新基因型毒株

《Microbiology Spectrum》：Development of a TaqMan probe-based PCR for the detection of porcine bocavirus group 3 and identification of a novel genotype strain

为特异性检测猪博卡病毒（PBoV）3群（G3），研究人员建立了一种靶向NS1基因的TaqMan探针实时聚合酶链反应（PCR）。该PCR的相关系数和扩增效率分别为0.994和102.9%。该PCR与猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪δ冠状病毒（PDCoV）基因组无交叉反应，检测限为每个反应100拷贝。该PCR批间和批内变异系数分别为1.38–2.71%和0.23–0.67%。通过所建立PCR检测采集自新疆、甘肃、青海、宁夏和陕西的719份田间样本，阳性率分别为80.82%、44.51%、97.50%、98.94%和93.60%。此外，测定了PBoV G3与PEDV/TGEV/PDCoV/猪圆环病毒2型（PCV2）的共感染，观察到双重感染、三重感染、四重感染和五重感染。进一步，对从五省随机选择的10份阳性样本（每省2份）进行了全基因组序列测定，系统发育分析将所有10株归入PBoV G3，但其中1株形成独立分支，表明其为PBoV G3中的新毒株。所建立PCR为PBoV G3检测提供了可靠工具，并有助于了解其分布和流行。

研究背景：猪博卡病毒（PBoV；无囊膜单链DNA病毒）属于细小病毒科博卡病毒属，可威胁猪群健康并具有潜在公共卫生意义。PBoV在腹泻猪尤其是幼龄猪粪便中流行较高，但尚无永生化细胞系可用于分离和增殖，基础研究受限。已有常规多重PCR、环介导等温扩增、TaqMan实时PCR、EvaGreen多重实时PCR、双纳米PCR、SYBR Green双重实时PCR、序列非依赖单引物扩增、巢式PCR及核酸序列依赖扩增等方法，但引物设计基于不同参考株，且PBoV核苷酸多样性高，可能出现假阴性。PBoV G3为中国猪群优势群，已有报道中国约20个省份PBoV阳性率为7.3%–64%，因此需要特异、敏感、通用的检测方法以监测PBoV G3流行并认识其分布。研究人员据此建立TaqMan探针实时PCR，检测田间样本，分析共感染并鉴定新基因型毒株，为PBoV G3检测和流行病学监测提供工具。

关键技术方法：研究人员基于GenBank中PBoV G3全基因组序列，用MegAlign分析并在NS1基因保守区设计通用引物和TaqMan探针（5′端FAM、3′端BHQ1），构建标准重组质粒并制备10倍系列稀释标准品，建立并优化TaqMan实时PCR，评价特异性、灵敏度和重复性；检测2022—2023年采集自新疆、甘肃、青海、宁夏、陕西的719份粪便田间样本，并用SYBR Green I实时PCR和常规PCR验证；对PBoV G3阳性样本检测PCV2、PEDV、PDCoV、TGEV以分析共感染；每省随机选2份阳性样本共10份进行全基因组扩增、克隆测序、SeqMan II组装，并以MEGA6.0邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树。

研究结果：Establishment of the PCR（PCR的建立）：以1×10⁷至1×10¹ copies/μL标准重组质粒优化引物、探针浓度和反应条件，所建PCR可高效检测靶基因，R²为0.994，扩增效率为102.9%。Specificity of the PCR（PCR的特异性）：以PRRSV、CSFV、TGEV、PEDV、PDCoV、PPV的DNA/cDNA及PBoV G3和标准质粒检测，仅PBoV G3和标准质粒呈阳性，与上述病毒无交叉反应，且各病毒模板完整性经特异性引物验证，表明特异性良好。Sensitivity of the PCR（PCR的灵敏度）：检测1×10⁷–1×10¹ copies/μL标准质粒及水模板，1×10¹ copies与水模板Ct值约35；150份水模板Ct值约35，故将Ct≥35定义为阴性；常规PCR检测限为1×10³ copies，表明所建PCR灵敏度高于常规PCR。The reproducibility of the PCR（PCR的重复性）：检测1×10¹–1×10⁷ copies/μL标准质粒，批内和批间变异系数（CV）分别为0.23–0.67%和1.38–2.71%，均低于10%，表明重复性好、变异性低。Detection of clinical samples（临床样本检测）：719份样本经所建PCR、常规PCR和SYBR Green I实时PCR检测，所建PCR阳性率为新疆80.82%、甘肃44.51%、青海97.50%、宁夏98.74%、陕西93.60%；常规PCR和SYBR Green I实时PCR检出的阳性样本均被所建PCR检出，部分两者阴性样本经所建PCR判为阳性并经随机测序确认，表明所建PCR更敏感；对579份PBoV G3阳性样本分析共感染，PDCoV和PCV2最常见，观察到PBoV+PCV2 71份、PBoV+PDCoV 48份、PBoV+PCV2+PDCoV 142份、PBoV+PCV2+PEDV+PDCoV 44份及PBoV+PCV2+PEDV+PDCoV+TGEV 17份等双重至五重感染，表明中国猪群PBoV感染复杂。Complete genome sequence analysis（全基因组序列分析）：10份阳性样本全基因组系统发育均属PBoV G3，但PQ757637形成独立分支；其基因组5060 bp，GC含量52.52%，全基因组和开放阅读框（ORF）系统发育均远离其他猪博卡病毒并在博卡病毒属内形成独立簇；其基因组与PBoV G3其他株同源性67.5–74.2%，NS1基因与其他PBoV G3株序列一致性31.9–80.4%；按国际病毒分类委员会（ICTV）以非结构基因DNA序列95%同源性定义种的标准，PQ757637应归为新型猪博卡病毒种的原型病毒，提示PBoV广泛遗传多样性。

讨论与结论：讨论指出，PBoV常在胃肠道疾病猪中检出，腹泻猪流行率高于健康猪；无永生化细胞系限制其致病机制研究，故需可靠检测方法。已有PCR因PBoV核苷酸多样性可能假阴性；PBoV G3为中国优势群，故研究人员靶向NS1基因保守区建立通用TaqMan探针PCR。与Zhou et al.建立的TaqMan探针PCR相比，所建PCR的R²几乎相等且批内、批间CV更低，两者特异性均高；Zhou et al.方法灵敏度更高，可能因靶基因不同。719份西北样本总阳性率为80.52%（579/719），宁夏、青海、陕西阳性率很高，与SYBR Green I实时PCR结果一致，可能因样本为腹泻粪便；既往报道中国东部、南部沿海及中部存在PBoV，提示其在中国猪场广泛分布。所建PCR阳性率高于SYBR Green I实时PCR的74.27%（534/719）和常规PCR的37.97%（273/719），且测序确认其检测准确性。遗传关系显示这些毒株属PBoV G3但形成不同分支，并发现PBoV G3内新株，符合PBoV遗传多样性。共感染分析中，PBoV尚未明确为主要病原或协同因子，常与肠道病原病毒同时检出；PBoV与PEDV/TGEV/PCV2同时检出与既往报道一致；双重至五重感染表明猪群PBoV感染复杂，但PBoV是否促进其他猪肠道病原感染及反之尚不清楚；有报道PCV2可能增强PBoV感染；PBoV免疫反应研究有限，NP1蛋白可抑制干扰素刺激基因表达并抑制仙台病毒诱导的IFN-β；PBoV G3曾发生重组，需进一步研究全面理解其流行。研究结论翻译：研究人员成功建立了一种用于PBoV G3通用检测的TaqMan探针实时PCR方法。利用该检测方法，研究人员调查了中国西北省份PBoV G3的流行情况，分析了其与主要肠道病原体的共感染及这些省份PBoV G3毒株的遗传关系，并在PBoV G3内鉴定出一株新毒株。该方法为现场监测提供了可靠而准确的工具，并将促进对中国PBoV G3流行病学的深入理解。