基于基因组解析的动胶菌属（Zoogloea）分类学、全球分布及胞外多糖合成潜力的系统研究

《mSystems》：Genome-resolved taxonomy, global distribution, and EPS potential of Zoogloea, the canonical floc-former in wastewater treatment systems

　　

： 细菌属动胶菌属（Zoogloea）是全球污水处理厂（WWTPs）中丰度排名第四的菌属，在絮凝形成和营养物去除中发挥关键作用，但当其高度富集时也可能导致黏性膨胀（viscous bulking）。历史上，Zoogloea的分类归属一直存在不一致性，部分分类单元曾基于表型特征被归类，随后又被重新划分至其他科或目。这种混乱状况不仅模糊了Zoogloea的物种身份及其分布格局，也阻碍了对该菌属絮凝形成机制的理解——该机制此前被归因于可能并非源自系统发育学意义上Zoogloea的多糖。研究人员利用其从全球活性污泥系统中收集的超过22,000个高质量基因组（MiDAS全球基因组目录），鉴定出47个归属于系统发育学定义Zoogloea的基因组。结合丰度数据，该研究得以厘清该属的分类学、生物地理学分布及代谢多样性。在此框架基础上，研究人员通过筛查MiDAS全球基因组目录和GTDB数据库，绘制了近期鉴定的Zoogloea相关絮凝形成多糖生物合成基因簇（BGC）的系统发育分布图谱。该基因簇在伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）内的多个属中被鉴定到，包括Zoogloea、Thauera、Azoarcus及Ca. Accumulibacter，以及若干此前未描述的类群。该基因簇高度保守，仅在基因组成和共线性上存在微小差异，提示相应多糖结构可能存在差异。编码该基因簇的基因组同时一致性地含有共现的絮凝调控基因，表明活性污泥系统中存在一种普遍且广泛的絮凝形成机制。 重要性：活性污泥系统的稳定运行依赖于微生物絮凝体的形成，以实现生物质与处理出水的分离。絮凝形成由微生物产生的胞外聚合物（EPS）介导，然而这些聚合物的身份、分布及生物合成途径仍缺乏系统表征。Zoogloea被广泛认为是与污水处理系统中EPS产生相关的典型模式絮凝形成菌属。然而，其分类学历史上一直存在问题，因为生物体常基于形态学特征被归入Zoogloea，导致广泛的错误分类。这模糊了归因于该属的多糖的真实来源及其更广泛的系统发育分布，而这一问题尚未被系统性地解决。本研究在全球基因组数据集上绘制了Zoogloea相关多糖生物合成基因簇的分布图谱，为将系统发育学定义的分类单元与絮凝形成潜力建立关联提供了框架。该研究增进了对活性污泥系统中EPS产生的理解，并可能为强化资源回收策略提供支持。

论文解读文章

一、研究背景与科学问题

活性污泥（Activated Sludge, AS）污水处理工艺依赖于微生物絮凝体的形成来实现处理出水与生物质的分离。动胶菌属（Zoogloea）被广泛视为关键的絮凝形成菌，不仅参与絮凝形成和营养物去除，在丰度过高时还可能引发黏性膨胀问题。除絮凝功能外，Zoogloea还具备反硝化能力，并可通过代谢多种糖类、糖醇、醇类、氨基酸和蛋白质来降解有机碳。该菌属不仅存在于污水处理系统中，也广泛分布于土壤和自然水生环境中。

然而，Zoogloea的分类学历史长期存在混乱。许多细菌曾基于表型特征——包括产生胶状胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances, EPS）基质——被归入该属。经典的“zooglan”多糖于1980年从Zoogloea ramigera 115菌株中分离，但该菌株后来被重新分类为Duganella zoogloeoides，导致系统发育学定义的Zoogloea所产生的多糖始终未被表征。近期，研究人员在Z. resiniphila中鉴定到一个包含26个基因的、对絮凝形成至关重要的生物合成基因簇（Biosynthetic Gene Cluster, BGC），该基因簇编码Wzx/Wzy依赖型胞外多糖合成系统，并包含8个糖基转移酶及两个天冬酰胺合成酶（asnH和asnB）。此外，一个由7个基因组成的小型辅助基因簇（epsB2、prsK、prsR、prsT、ugd、mltE和degQ2）也被证实参与絮凝形成。编码PEP-CTERM蛋白的基因同样与絮凝相关，其表达受替代sigma因子RpoN及辅助EPS基因簇内编码的PrsK–PrsR双组分系统调控。

尽管已在多个活性污泥属中鉴定到Zoogloea多糖BGC和PEP-CTERM蛋白的同源基因，并有人提出将其作为絮凝形成的生物标志物，但这些基因的分布、丰度及基因组组织方式尚未得到系统解析，且不清楚这些基因是否始终以完整BGC的形式共现。研究人员所拥有的超过22,000个来自全球污水处理厂的长读长高质量宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs）目录，为系统解析基因簇分布和共线性提供了独特资源。

二、研究目的与意义

本研究旨在通过基因组解析分析结合全球16S rRNA基因扩增子丰度数据，重新评估Zoogloea的分类学、代谢多样性及物种水平生物地理学分布；同时系统绘制Zoogloea相关多糖BGC及辅助EPS基因簇在细菌域中的分布与保守性图谱，以评估其系统发育范围和功能相关性。该研究为将系统发育学定义的分类单元与絮凝形成潜力建立关联提供了框架，增进了对活性污泥系统中EPS产生的理解，并可能为强化资源回收策略提供支持。

三、主要关键技术方法

研究人员使用了以下关键技术方法：（1）对三株Zoogloea分离菌株（Z. caeni DSM 19389、Z. oleivorans DSM 28387和Z. resiniphila DSM 16780）进行基因组测序与组装，采用GridION或PromethION平台及R10.4.1化学试剂，使用Flye v2.9.2组装并经Medaka v1.8.0抛光；（2）利用GTDB-Tk v2.4.1进行系统发育分类，以120个单拷贝标记基因构建最大似然基因组树（IQ-TREE2 v2.2.6）；（3）使用FastANI v1.33评估全基因组相似性（平均核苷酸一致性，ANI）；（4）基于16S rRNA基因构建系统发育树并与MiDAS 5.3数据库比对获得分类信息；（5）使用diamond v2.1.9进行blastp同源搜索，结合HMMER v3.4构建隐马尔可夫模型（HMM）筛查基因簇；（6）使用epsSMASH工具预测多糖基因簇，并以BIG-SCAPE进行相似性网络分析。样本来源包括MiDAS全球基因组目录（>22,000个高质量MAGs）、GTDB R226和R220数据库，以及MiDAS 4研究的929个活性污泥样本（来自480个WWTPs）。

四、研究结果

（一）揭示全球污水处理系统中Zoogloea的多样性与分布

基于MiDAS全球16S rRNA基因V1–V3扩增子数据，Zoogloea是全球活性污泥中丰度第四高的菌属，平均相对丰度为1.79%。物种水平的生物地理学模式清晰可见：midas_s_1080是欧洲最丰富的Zoogloea物种，但在非洲、亚洲和南美洲的大多数污水处理厂中缺失；Z. caeni则是这些大洲的优势物种；Z. oleivorans主要在欧洲国家及北美、南美、中国和澳大利亚的部分工厂中流行。Zoogloea的累积相对丰度随污水处理工艺类型的推进而下降，在仅进行碳去除的工厂中最高，这与Zoogloea在高负荷碳去除工厂中大量存在并有时引发黏性膨胀的观察一致。

（二）连接基因组与16S rRNA基因谱

研究人员整合了3个分离菌株基因组、47个来自MiDAS全球基因组目录的高质量MAGs和10个来自GTDB R226的高质量Zoogloea基因组，共代表16个已知物种和3个新物种。通过将基因组的16S rRNA基因映射至MiDAS 5.3参考数据库，发现16S rRNA基因系统发育能为大多数Zoogloea物种提供物种级分辨率，但这些物种往往仅有占位名称。

（三）回收并鉴定三个未知Zoogloea物种的MAGs

研究人员共回收了3个未在GTDB R226中代表的Zoogloea物种（Z. caeni、Z. pseudoryx和Z. singapurae）的5个MAGs。Z. caeni此前在GTDB R226中无物种代表，现由两个高质量基因组代表。两个与Z. oryzae密切相关的MAGs被命名为Z. pseudoryx。Z. singapurae的一个MAG编码多个16S rRNA基因，其分类存在冲突，分别被归类为Z. oryzae或在MiDAS数据库中无物种级代表（一致性<98.7%）。

（四）具有占位名称的未描述Zoogloea物种

多个仅具有GTDB和MiDAS占位名称的物种被回收并提出了新名称，包括Z. temperans（midas_s_1080）、Z. iberica（midas_s_1080）、Z. sparsa（midas_s_14633）、Z. remota（midas_s_16880）和Z. asiatilux（midas_s_11160）。Z. dispersa（midas_s_4920）是一个在全球范围内被检测到但在特定工厂中出现的物种。Zoogloea模式种Z. ramigera此前在GTDB R226中没有符合MIMAG标准的高质量代表，现由MiDAS全球基因组目录中的两个高质量MAGs代表。Z. resiniphila未被用作GTDB R226中的物种名，但研究人员建议将其用于GCA_020161115.1和GCA_986340685。

（五）Zoogloea内部的代谢多样性

所有Zoogloea物种均编码与反硝化相关的关键基因（nirS、norBC和nosZ），少数基因组偶发缺失nisS或nosZ。所有基因组均编码周质硝酸盐还原酶（napAB），而无一编码膜结合呼吸型硝酸盐还原酶（narGHI）。napAB在基因组中一致地位于norBC附近，提示其可能顺序发挥功能。多个物种编码固氮潜力基因（nifDHK）。与多磷酸盐积累和储存相关的基因在所有基因组中均被检测到，包括低亲和力磷酸盐转运蛋白（pit）和高亲和力磷酸盐转运蛋白（pstSCAB），以及ppk和ppx基因。聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成基因（phaABC）被检测到，但仅部分物种编码解聚酶phaZ。仅5个物种编码糖原代谢相关基因。蓝藻素合成酶（cphA）基因在整个属中广泛存在，但蓝藻素酶（cphB）基因较少。完整的SOX硫氧化途径存在于19个物种中的10个，其余物种携带截短途径。大多数缺乏完整SOX系统的基因组编码硫化物醌氧化还原酶Sqr，所有基因组均含有FccA和FccB。

（六）胞外多糖生物合成基因组潜力在整个Zoogloea属中保守

研究人员筛查了整个属的絮凝多糖基因簇。所有基因组中均检测到同源基因，但拷贝数各异。zooGT8和zooGH在多个基因组中缺失。当以12个核心基因（wzi、wza、etk、wzc、zooP、zooSA、zooM3、zooM2、zooGT1、epsH、asnH和wzy）在近距离内共现为标准时，仅两个基因组（Z. resiniphila和Z. dura）编码完整基因簇。基因簇共线性在物种水平保守。在所有基因组中，前9个基因的顺序（lolD、wzi、wza、etk、wzc、zooP、zooSA、zooM3和zooM2）保守，仅在少数情况下被转座酶插入中断。

（七）Zoogloea内存在两种基因簇类型

约半数基因组（23/60）编码含有糖基水解酶zooGH的基因簇变体。缺乏zooGH的基因组通常使epsH侧翼于9个保守基因，且常编码由糖基转移酶分隔的两个asnH拷贝。两种基因簇类型的出现不遵循系统发育聚类。缺乏zooGH的部分基因组在基因簇内编码另一种糖基水解酶（家族99），这些基因组属于Z. dominans（15/15）和Z. filtricola（1/1）。仅少数基因簇编码asnB（4/60），但所有物种的基因组其他位置均检测到同源基因。

（八）基因组背景及絮凝形成的其他重要基因

除查询的同源基因外，Zoogloea多糖基因簇内还定位到其他基因，主要与多糖代谢相关，如GDP-甘露糖6-脱氢酶和多糖脱乙酰酶。在所有情况下，基因簇上游均存在外膜脂蛋白分选基因，其后是吡哆胺5′-磷酸氧化酶结构域和SpoU家族RNA甲基转移酶。3′端变异较大，通常由鸟氨酸氨甲酰转移酶或δ-氨基乙酰丙酸脱水酶构成。几乎所有Zoogloea基因组均编码辅助基因簇和pepA。

（九）Zoogloea多糖基因簇在伯克霍尔德氏菌目中广泛分布

在MiDAS全球基因组目录中，该多糖基因簇主要在伯克霍尔德氏菌目（Burkholderiales）中被检测到（201个命中），另有Ga0077536（13个命中）和假单胞菌目（Pseudomonadales）（4个命中）中的检测。在伯克霍尔德氏菌目中，约10%的基因组携带该基因簇。大多数命中位于红环菌科（Rhodocyclaceae）（162/218）。Ga0077536属的12个MAGs中有11个编码该基因簇，Methyloversatilis中25个基因组中有21个编码。GTDB R220的筛查结果类似，主要在红环菌科中检测到（103/145）。680个MiDAS MAGs编码一个缺少wzi的相似基因簇，其中约半数基因组中wzi位于其他位置。多个基因组的zooSA和zooM3之间含有一个额外基因wecB，编码非水解型UDP-N-乙酰葡糖胺2-表异构酶。

（十）辅助基因簇的共现提示广泛的絮凝形成潜力

218个MiDAS MAGs还编码辅助基因簇的5个必需基因（epsB2、prsK、prsR、prsT和ugd）。大多数（157/218）基因组的这5个基因以基因簇形式排列。除一个基因组外，所有基因组均编码至少一个pepA同源基因。

（十一）携带Zoogloea多糖基因簇物种中的额外多糖生物合成系统

使用epsSMASH工具筛查，所有预测携带该基因簇的Zoogloea基因组均被捕获。大多数Zoogloea物种编码至少两个不同的多糖基因簇。两个Z. ramigera基因组被预测携带Pel基因簇。在MiDAS全球基因组中，Pel最为普遍（34/218），主要存在于Quisquiliibacterium、Azonexus、Propionivibrio和Methyloversatilis属中。每个基因组编码1至4个不同的多糖生物合成基因簇。

五、讨论与结论

本研究确立了Zoogloea物种是污水处理系统中丰度高、分布广且功能重要的成员，同时表现出清晰的生物地理学结构和代谢分化。利用MiDAS全球基因组目录，研究人员细化了该属的分类学，为先前未被识别的物种回收了高质量基因组，并为仅以占位名称存在的分类单元提供了名称。

Zoogloea多糖生物合成基因簇在整个属中广泛保守，基因组织的微小差异可能贡献于多糖结构的差异。在Zoogloea之外，该基因簇在伯克霍尔德氏菌目中广泛分布，特别是在红环菌科中，存在于多个已确立的絮凝形成属以及Ga0077523和Methyloversatilis等属中——后者被鉴定为强候选絮凝形成菌。PEP-CTERM相关絮凝调控基因与Zoogloea多糖基因簇的一致共现表明，多个细菌谱系中存在保守且广泛共享的絮凝形成机制。这些发现鉴定了一个参与废水生态系统絮凝形成的核心且广泛分布的多糖系统。然而，Zoogloea絮凝多糖的化学结构、变异性和功能特性仍未解决，这凸显了开展靶向实验表征的重要优先性。