剪接体结构研究：多样性及调控机制的新见解

《Current Opinion in Structural Biology》：Structural studies of the spliceosome: emerging insights into diversity and regulatory mechanisms

　　

剪接体是一个复杂的大分子机器，催化前体mRNA（pre-mRNA）剪接这一必需的细胞过程。过去十年间，大量稳定剪接体组装中间体的高分辨率结构得以解析，为基础剪接机制提供了结构框架。然而，该领域在以下方面仍滞后：对单个剪接因子精确轨迹的机制理解、细胞背景下剪接的调控与组织、以及剪接质量控制机制及其与人类疾病的联系。在本综述中，研究人员强调近期结构研究如何弥合了部分知识空白，并推进了对pre-mRNA剪接的机制理解。研究人员讨论了关于外显子定义问题、组装因子在小核糖核蛋白颗粒（snRNP）生物发生中的作用、剪接体相关质量控制以及U12依赖型剪接通路的最新见解。研究人员还对该领域的未来发展提供了展望。

研究背景方面，真核生物中前体mRNA（pre-mRNA）的内含子切除及外显子连接是必需的细胞过程，异常剪接与遗传性和体细胞性人类疾病相关。该过程由剪接体催化，剪接体是由5种小核RNA（snRNA）和超过100种蛋白质组成的兆道尔顿（MDa）RNA-蛋白质复合物。剪接体作为结构生物学靶标面临重大挑战，主要由于剪接周期中发生的组成和构象重排程度。过去十年间，单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析了大量已知剪接体组装中间体的高分辨率结构，但该领域在单个剪接因子精确轨迹、细胞背景下剪接的调控与组织、剪接质量控制机制及其与人类疾病联系等方面仍存在知识空白。研究人员开展本综述，旨在强调近期结构研究如何弥合这些知识空白并推进对pre-mRNA剪接的机制理解。研究结论指出，过去十年的结构研究在理解基础剪接机制及其调控方面取得了巨大进展，但仍存在许多开放性问题需要未来解决，包括剪接组分在复杂构象重排中的精确轨迹、pre-mRNA剪接与其他核过程的偶联机制、AI结构预测方法在RNA及RNA-蛋白质复合物中的应用局限、更广泛pre-mRNA底物的结构研究以及细胞内原生环境中剪接体的可视化等。该研究的重要意义在于为理解剪接体多样性及调控机制提供了结构框架，并为未来研究方向提供了指引。

关键技术方法方面，研究人员主要采用单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）解析剪接体组装中间体的高分辨率结构；利用小分子剪接抑制剂和RNA解旋酶显性负性变体将剪接体停滞在特定状态；通过亲和标签从人类细胞中纯化20S U5 snRNP复合物；使用体外重构系统进行剪接体组装的受控分析；以及从CHAETOMIUM THERMOPHILUM和SCHIZOSACCHAROMYCES POMBE中纯化DHX15相关天然剪接复合物。

研究结果方面，在外显子定义问题部分，两项近期研究利用外显子定义模型研究剪接体组装和激活过程中的关键转变，发现停滞在pre-B和B阶段的交叉外显子（CE）复合物在结构上与交叉内含子（CI）对应物非常相似，表明CE和CI组装途径在pre-B阶段汇聚；Zhang等捕获了二聚体形式的复合物，并证明一个CE pre-B复合物原聚体的tri-snRNP能够以反式方式与另一个原聚体中结合5′SS的U1 snRNP相互作用，从而实现DDX23催化的5′SS从U1到U6 snRNA的交接；通过体外重构系统将剪接体激活解析为多个阶段。在伴侣介导的snRNP生物发生部分，两项近期研究通过CD2BP2亲和标签从人类细胞中纯化20S U5 snRNP复合物并解析其冷冻电镜结构，揭示了CD2BP2的多结构域架构及其通过GYF结构域招募Dim1的机制，以及TSSC4在BRR2解旋酶定位前的早期组装中间体作用；这些研究提供了组装伴侣如何定位U5 snRNP前体复合物移动结构域、招募特定因子以及作为占位者防止过早募集tri-snRNP组分的见解。在U12依赖型剪接通路部分，minor Bact复合物的冷冻电镜结构首次揭示了minor剪接体的架构，鉴定了5种新的minor剪接体特异性蛋白（SCNM1、ARMC7、RBM48、CRIPT、PPIL2）并提出了其初步功能；两项近期结构研究利用DDX23显性负性变体停滞体外组装的minor剪接复合物于pre-B阶段以及从HEK293细胞分离的U11 snRNP体外重构5′SS识别，可视化了U11 snRNP与其同源5′SS结合的复合物架构，包括5种minor剪接体特异性因子（ZMAT5、SNRNP25、SNRNP35、SNRNP48和PDCD7）；研究发现U12型5′SS与U11 snRNA的碱基配对相比U2型复合物有7个核苷酸（nt）的偏移，内含子保守核苷酸+3和+4与U11 snRNA茎环3形成非经典碱基三联体相互作用。在剪接体相关质量控制部分，两项近期研究首次发现剪接体可以直接识别一类特定的次优5′SS并将其靶向丢弃，这是通过利用G-patch家族蛋白因子GPATCH1实现的；通过纯化DHX15相关的天然剪接复合物，捕获并解析了两种新型剪接复合物（ctB?Q和Bd）的冷冻电镜结构，两者均已发生催化激活但停滞在剪接第一步催化之前，其定义性特征是存在GPATCH1和DHX35；RBM5结合的U2 snRNP复合物结构揭示了RBM5结合SF3B1并帮助将DHX15定位在分支螺旋附近，同时与RBM5和U2SURP一起空间阻断剪接体的进一步组装。

讨论部分总结了当前局限与未来展望，包括：（1）单个剪接组分在复杂构象重排中的精确轨迹了解不足，需要开发更好的生化方法以及强大的冷冻电镜数据处理算法，分子动力学模拟将发挥越来越重要的作用；（2）pre-mRNA剪接与其他核过程的偶联机制了解不足，转录与剪接机器之间相互作用的细胞背景下的重要性仍有待确定，与pre-mRNA 3′端加工机器偶联的结构和机制基础仍不明确；（3）AI结构预测方法由于RNA分子的高度动态性和RNA结构数据有限，准确预测RNA及RNA-蛋白质复合物结构仍极具挑战性；（4）目前大多数剪接体结构来自少量优化pre-mRNA底物的核提取物剪接反应，应用于更广泛的pre-mRNA可能提供对底物特异性剪接体组成、组装动力学和调控的进一步见解；（5）从细胞或核提取物剪接反应中纯化的剪接复合物的结构研究本质上缺失了剪接体组装的细胞背景，通过冷冻电子断层扫描（cryo-ET）在天然细胞环境中可视化剪接体有望克服这一局限并成为该领域的下一个前沿。研究结论翻译：过去十年的结构研究在理解基础剪接机制及其调控方面带来了巨大进展，本综述对此进行了选择性强调。然而，仍存在许多开放性问题需要未来解决，涉及与pre-mRNA剪接相关的生物学问题以及结构生物学技术的局限和未来发展。