《Current Research in Microbial Sciences》：Quantitative Phosphoproteome analyses of
Ophiocordyceps sinensis Reveal Phosphoproteins Modulating Primordium Formation
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本研究首次对冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）从僵虫（ST）到原基（PR）转变过程中的磷酸化蛋白质组进行了4D无标记定量分析。研究人员共鉴定出8,417条独特肽段，其中5,851条为磷酸化肽段，对应6,359个磷酸化位点。
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本研究首次对冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）从僵虫（ST）到原基（PR）转变过程中的磷酸化蛋白质组进行了4D无标记定量分析。研究人员共鉴定出8,417条独特肽段，其中5,851条为磷酸化肽段，对应6,359个磷酸化位点。在PR与ST的比较中，共检测到642个差异磷酸化肽段，对应400个差异磷酸化蛋白（DPPs），其中266个蛋白磷酸化水平显著上调，134个显著下调。功能富集分析表明，这些DPPs主要富集于胞吐作用、高尔基体囊泡运输、细胞壁重塑及氧化应激响应等生物学过程。值得注意的是，MAPK激酶激酶Ste7的Ser362、Thr388、Thr390和Ser403四个磷酸化位点，以及MAPK Fus3 TxY基序中的Thr171和Tyr173位点在PR阶段均表现出显著升高的磷酸化水平。通过AlphaFold 3.0结构预测和酵母双杂交（Y2H）实验证实了Ste7与Fus3之间的相互作用，其中Ste7 Ser362和Thr388被鉴定为介导Ste7–Fus3相互作用的关键候选磷酸化位点。在蛹虫草（Cordyceps militaris）中的功能验证表明，ste7基因敲除突变体（ΔSte7）完全丧失了原基形成和子实体发育能力，同时促进了气生菌丝生长和分生孢子产生。转录组分析进一步揭示，Ste7通过调控细胞壁重塑相关基因（如几丁质合酶、葡聚糖酶等）和氧化还原稳态相关基因的表达来协调原基发生。该研究首次绘制了冬虫夏草原基形成过程中的磷酸化蛋白质组图谱，揭示了Ste7–Fus3模块通过协调细胞壁重塑和氧化应激响应来触发原基起始的分子机制，为这一珍稀药用真菌的靶向遗传改良和标准化栽培奠定了理论基础。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
冬虫夏草（Ophiocordyceps sinensis）是一种具有重要药用和营养价值的虫生真菌，天然分布于青藏高原等高海拔地区。其生物活性成分主要包括核苷类、甾醇类、甘露醇及多糖等，子实体富含这些活性物质，其发育程度与整体产量密切相关。由于巨大的市场需求，野生冬虫夏草资源已被过度采挖，种群面临濒危。该真菌侵染蝙蝠蛾幼虫后形成僵虫（ST），随后从虫尸头部萌发产生子实体，这一过程在野外需历时3–5年，表明子实体发育是一个精密且受遗传程序调控的生物学过程。原基（PR）是子实体发育的起始和关键阶段，其形成依赖于菌丝分支模式的重编程，以构建菌丝紧密黏附的致密三维结构。
蛋白质磷酸化是真菌中最普遍的翻译后修饰（PTM），调控信号转导、细胞周期进程、程序性细胞死亡及碳代谢等广泛生物学过程。尽管已有研究表明磷酸化修饰在真菌子实体发育中发挥关键调控作用，但针对冬虫夏草原基形成过程的磷酸化蛋白质组学研究此前尚未见报道。因此，研究人员开展了本研究，旨在通过4D无标记定量磷酸化蛋白质组学技术，系统解析冬虫夏草从ST到PR转变过程中的动态磷酸化变化，筛选与PR发育相关的关键差异磷酸化蛋白（DPPs）及核心磷酸化事件，为理解该珍稀真菌的发育调控机制提供分子层面的新见解。
二、主要技术方法
研究人员从四川省阿坝州海拔3000–4000 m区域采集成熟冬虫夏草子实体，收集子囊孢子并感染4–5龄寄主幼虫，分别收集僵虫和新出现的原基样本，每阶段设置三个生物学重复。采用4D无标记定量磷酸化蛋白质组学技术，通过固定化金属离子亲和色谱（IMAC）富集磷酸化肽段，结合timsTOF Pro质谱仪进行平行累积连续碎裂（PASEF）模式的数据依赖性采集。使用MaxQuant软件进行数据库检索，以冬虫夏草Co18菌株蛋白数据库（含6,968条蛋白序列）为参考，严格控制在PSM和蛋白水平FDR均小于1%，仅保留定位概率≥0.75的Class I磷酸化位点用于后续分析。此外，研究人员还利用AlphaFold 3.0进行Ste7–Fus3蛋白-蛋白相互作用结构预测，采用酵母双杂交（Y2H）实验验证相互作用，并在模式菌蛹虫草（C. militaris）中通过农杆菌介导转化（ATMT）构建ste7基因敲除和回补菌株进行功能验证，结合转录组测序分析差异表达基因（DEGs）。
三、研究结果
3.1 磷酸化蛋白质组特征分析
研究人员共鉴定出8,417条独特肽段，其中5,851条为磷酸化肽段，对应6,359个磷酸化位点。磷酸化肽段长度主要集中在10–30个氨基酸，与胰蛋白酶消化肽段的预期大小分布一致。相对标准偏差（RSD）分析表明ST和PR样本具有可比的低RSD值，证明磷酸化位点定量具有良好的重复性。主成分分析（PCA）清晰分离了ST和PR两个发育阶段，PC1占77.0%总方差，表明两个阶段具有显著不同的阶段特异性磷酸化蛋白质组特征。
3.2 差异磷酸化肽段和蛋白的鉴定与比较分析
在PR与ST的比较中，共检测到642个差异磷酸化肽段，其中477个磷酸化水平显著升高，165个显著降低。对应鉴定出400个DPPs，其中266个磷酸化水平显著升高，134个显著降低。值得注意的是，PR阶段整体磷酸化水平显著高于ST阶段，表明蛋白质磷酸化在冬虫夏草原基发育中发挥重要作用。在磷酸化位点类型分布上，上调磷酸化位点中丝氨酸（S）占76.94%、苏氨酸（T）占22.64%、酪氨酸（Y）仅占0.42%；下调磷酸化位点中S占83.03%、T占16.87%。基序富集分析鉴定出[RxxSP]为pS的优势基序、[xTP]为pT的优势基序，精氨酸常位于pS位点-3位置，脯氨酸富集于pS和pT位点+1位置。
3.3 功能分类分析
GO功能富集分析显示，磷酸化水平显著升高的DPPs主要富集于胞吐作用（GO:0006887）、细胞分泌（GO:0032940）、高尔基体囊泡运输（GO:0006891）、蛋白定位到膜（GO:0072657）、细胞表面受体信号通路（GO:0007166）和细胞氧化应激响应（GO:0034599）等生物学过程。分子功能方面主要富集于磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸结合（GO:0005546）和钙调蛋白依赖性蛋白激酶活性（GO:0004683）。亚细胞定位分析显示这些DPPs主要分布于线粒体基质、核仁和膜皱褶。KEGG通路分析表明，磷酸化水平显著升高的DPPs富集于甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（map00026）及甘油磷脂代谢（map00564）通路。
3.4 关键DPPs分析
与细胞壁重塑相关过程的DPPs分析显示，外泌复合体组分Sec8（T5AQW1）、SNARE蛋白Sec9（T5A976）、Sec7结构域蛋白（T4ZY17）、Gcs1同源蛋白（T5AEJ4）、RhoGAP结构域蛋白（T5A677）以及MAPK级联核心组分MAPKK Ste7（T5ADZ7）和MAPK Fus3（T5AIB8）在PR阶段均表现出显著升高的磷酸化水平。甘油磷脂代谢通路中的溶血磷脂酶Nte1（T5ACX5）、磷酸胆碱胞苷酰转移酶（T5AQH6）和磷脂酶（T5A5G9）的磷酸化水平也显著升高。蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析表明，MAPK信号通过协调外泌复合体组装、细胞运输和脂质代谢来维持细胞壁完整性（CWI），从而调控原基起始。
在信号转导和氧化应激响应通路方面，研究人员发现MAPKK Ste7的Ser362、Thr388、Thr390和Ser403四个磷酸化位点在PR阶段均显著升高，其中Thr390位点变化倍数最高（4.24倍）。MAPK Fus3 TxY基序中的Thr171和Tyr173位点磷酸化水平分别升高6.67倍和4.33倍，这种差异反映了MAPK级联中典型的信号放大效应。钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMK/CMK）的Ser319和Ser321位点磷酸化水平也显著升高。此外，超氧化物歧化酶Sod1（T5A6F1）、过氧化氢酶Cat1（T5ADM3）、过氧化物酶体生成因子Pex19（T5ACT6）等氧化应激相关蛋白的磷酸化水平均显著升高。PPI网络分析鉴定出包含14个相互连接的DPPs网络，其中Ste7和Fus3为高连接度的枢纽节点。
3.5 生物信息学分析
保守结构域预测显示Ste7包含保守的PKc_Byr1_like结构域。多序列比对结果表明Ste7与其在多种真菌中的直系同源蛋白具有超过67%的序列同源性，MEME基序分析进一步证实这些蛋白在结构和功能上高度保守。STRING数据库预测Ste7与Fus3存在物理或功能关联，表明Ste7–Fus3模块在多种真菌中作为核心信号级联调控有性发育、次生代谢和致病性。
3.6 Ste7在蛹虫草原基发育中的调控作用
在蛹虫草中构建ste7基因敲除突变体（ΔSte7）和回补菌株（ΔSte7-c）进行功能验证。与野生型（WT）相比，ΔSte7突变体在PDA培养基上产生更丰富的气生菌丝，且从第3天到第8天分生孢子产量显著高于WT（约为WT的1.0–1.35倍）。在麦粒培养基上经15天光暗循环培养后，WT和ΔSte7-c菌株均观察到原基形成，而ΔSte7突变体未出现原基；经40天培养后，WT和ΔSte7-c产生子实体，而ΔSte7突变体仍停滞在菌丝阶段。这些结果表明Ste7是原基起始所必需的，同时抑制营养菌丝生长。
3.7 转录组数据分析
对ΔSte7与WT进行转录组比较分析，共鉴定出3,586个差异表达基因，其中1,702个上调、1,884个下调。基因集富集分析（GSEA）显示，显著下调的DEGs主要富集于氧化还原酶活性（GO:0016667）、二硫键氧化还原酶活性（GO:0015036）和分解代谢过程（GO:0030163）等生物学过程。23个下调DEGs富集于细胞壁（GO:0005618）和真菌型细胞壁（GO:0009277）相关GO条目，包括编码GPI锚定细胞壁蛋白Ecm33、细胞壁葡聚糖酶Scw4/Scw11、几丁质合酶（Chs）、ADAM8前体蛋白、胞外葡聚糖酶Crf1以及交配相关膜融合蛋白FIG1的基因。KEGG富集分析显示下调DEGs主要涉及SNARE囊泡运输相互作用（ko04130）、GPI锚生物合成（ko00563）、内吞作用（ko04144）、淀粉和蔗糖代谢（ko00500）、谷胱甘肽代谢（ko00480）和糖鞘脂生物合成（ko00603）等通路。同时，与无性发育相关的基因（如疏水蛋白hyd、转录因子abaA和几丁质合酶chs）在ΔSte7突变体中显著上调，表明Ste7通过抑制这些无性发育基因的表达来抑制菌丝生长。qPCR验证结果与转录组数据高度一致。
3.8 Ste7与Fus3的相互作用
AlphaFold 3.0结构预测获得pTM评分0.57和ipTM评分0.72，支持Ste7–Fus3存在推定相互作用。酵母双杂交实验证实了Ste7与Fus3之间的物理相互作用，其中Ste7 Ser362和Thr388被鉴定为介导Ste7–Fus3相互作用的关键候选磷酸化位点。
四、研究结论与意义
本研究首次绘制了冬虫夏草从ST到PR转变过程中的定量磷酸化蛋白质组图谱，系统揭示了原基形成过程中的关键磷酸化事件。研究结果表明，Ste7–Fus3 MAPK模块作为核心调控枢纽，通过协调细胞壁重塑和氧化应激响应来触发原基起始。Ste7 Ser362和Thr388是介导Ste7–Fus3相互作用的关键候选磷酸化位点。在蛹虫草中的功能验证证实Ste7是原基形成所必需的，其通过调控细胞壁重塑和氧化还原稳态相关基因的表达来促进原基形态发生。该研究为理解真菌原基发育的复杂调控机制提供了新的分子见解，为冬虫夏草的靶向遗传改良和标准化栽培奠定了坚实的理论基础。需要指出的是，由于冬虫夏草目前尚缺乏成熟的遗传转化体系，Ste7在冬虫夏草原基发育中的调控功能是基于蛹虫草中直系同源基因的功能证据推断而来，研究人员正在尝试建立冬虫夏草稳定的遗传转化系统，以期为未来的靶向遗传育种和基因功能深入研究提供支持。
