《Current Research in Microbial Sciences》：Metabolomic and Transcriptomic Characterization of
Actinokineospora bangkokensis 44EHWT: Enhancing Anti-anthracnose Production Through
N-Acetylglucosamine Supplementation
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放线菌门（Actinomycetota）长期被视为抗生素的重要产生菌。炭疽病由*Colletotrichum*属真菌（尤以*C. gloeosporioides*为主）引起，是一种广泛且严重的采后病害，在全球作物生产中造成重大经济损失，热带和亚热带地区尤为突出
放线菌门（Actinomycetota）长期被视为抗生素的重要产生菌。炭疽病由*Colletotrichum*属真菌（尤以*C. gloeosporioides*为主）引起，是一种广泛且严重的采后病害，在全球作物生产中造成重大经济损失，热带和亚热带地区尤为突出。化学杀菌剂的广泛使用导致病原菌抗药性发展，并对人类健康和环境构成风险，因此亟需从尚未充分开发的来源中寻找新型生物活性骨架。稀有放线菌属*Actinokineospora*仍是一个 largely untapped 的生物合成潜力来源，基因组分析表明其许多生物合成基因簇（BGCs）在标准实验室条件下处于沉默或弱表达状态。N-乙酰氨基葡萄糖（GlcNAc）不仅可作为放线菌的碳源，还可作为重要的信号分子，通过调节全局调控网络（尤其是DasR介导的调节子）多效性激活参与抗生素生物合成的沉默BGCs。然而，GlcNAc介导的诱导在*Actinokineospora*中的分子机制完全未被探索。本研究采用整合转录组学和代谢组学方法，探究GlcNAc补充对*Actinokineospora bangkokensis* 44EHWT次级代谢的影响，重点关注其对炭疽病致病真菌的抑制活性。研究人员检测了参与GlcNAc代谢的基因、*dasR*调控基因及生物合成基因簇，以表征与GlcNAc补充相关的转录响应。通过整合基因表达和代谢物谱分析，研究人员旨在阐明该响应背后的调控和代谢动态。本研究为GlcNAc响应性调控提供了见解，并凸显其作为增强稀有放线菌次级代谢产物生产的诱导策略的潜力。
**研究背景与问题**
放线菌门（Actinomycetota）自药物发现黄金时代以来一直被公认为抗生素的丰富来源，广泛分布于土壤、堆肥、植物、石灰岩、淡水、海洋环境、海绵、火山洞穴、热泉、沙漠和红树林等多样生态系统中，并持续被报道具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗病毒（含SARS-CoV-2）、抗利什曼原虫、酶抑制、重金属修复及抗真菌活性。根据可持续发展目标（SDGs），可持续农业是满足日益增长的粮食需求的最有效替代方案。炭疽病由*Colletotrichum*属真菌（尤以*C. gloeosporioides*为主）引起，是一种广泛且严重的采后病害，影响全球作物生产，热带和亚热带地区尤为突出，可影响蔬菜和水果等多种作物，导致 seedling blight、leaf blight、stalk rot 和 head blight 等症状，采前和采后感染造成约30%–40%可销售产品的产量损失。杀菌剂的广泛使用导致*Colletotrichum* spp.抗药性发展，并对人类健康和环境构成风险，因此亟需从尚未充分开发的来源中鉴定新型生物活性骨架。稀有放线菌代表了一个丰富但尚未充分开发的隐性次级代谢产物储库。*Actinokineospora*属被认为是一种稀有放线菌，目前描述了19个有效种。该属成员*Actinokineospora fastidiosa*已被报道产生多种次级代谢产物，包括L-异亮氨酸和N-烯丙氧羰基及十二烷基酯，对多食性作物害虫具有强生物活性。*Actinokineospora bangkokensis* 44EHWT最初从泰国曼谷象耳植物（*Colocasia esculenta*）根际分离，已被报道产生thailandins A和B，这两个化合物对炭疽病真菌和致病酵母表现出广谱活性。对thailandin生物合成基因簇（涉及I型聚酮合酶）的进一步研究揭示了一条不寻常的生物合成途径，将丁基丙二酰辅酶A延伸单元引入聚酮链。在35个与次级代谢产物生物合成相关的基因簇中，仅有两个与抗真菌活性相关。“一株多化合物”（OSMAC）方法用于激活在标准实验室培养条件下保持沉默或弱表达的BGCs，从而增强代谢物生产。该策略涉及改变营养可用性、物理参数（如温度）、共培养条件和其他环境因素。GlcNAc不仅作为放线菌的碳源，还作为重要的信号分子，已被提出可调节全局调控网络，特别是DasR介导的调节子，从而多效性激活参与抗生素生物合成的沉默BGCs。在*Streptomyces*物种（包括*S. clavuligerus*、*S. griseus*、*S. hygroscopicus*和*S. venezuelae*）中，GlcNAc信号可抵消DasR介导的抑制，解锁途径特异性调控因子并唤醒原本沉默的BGCs。这种靶向响应也延伸至稀有放线菌，例如GlcNAc补充可在*Micromonospora* sp. RV43中诱导3-甲酰吲哚和guaymasol，在*Rhodococcus* sp. RV157中诱导bacillibactin和surfactin，并提升*Actinokineospora* sp. EG49中次要actinosporins E–H的产量。值得注意的是，来自GlcNAc诱导的*Actinokineospora* sp.的一个新化合物表现出抗锥虫活性。然而，GlcNAc介导的诱导在*Actinokineospora*中的分子机制完全未被探索。*dasR*基因编码一个与氨基糖代谢和放线菌次级代谢物调控相关的GntR家族转录调控因子，已被报道影响初级代谢、发育和BGCs相关基因。然而，GlcNAc补充如何影响稀有放线菌的转录和代谢响应仍知之甚少。本研究采用整合转录组学和代谢组学方法探究GlcNAc补充对*Actinokineospora bangkokensis* 44EHWT次级代谢的影响，重点关注其对炭疽病致病真菌的抑制活性，检测参与GlcNAc代谢的基因、*dasR*调控基因及BGCs，以表征与GlcNAc补充相关的转录响应。通过整合基因表达和代谢物谱分析，研究人员旨在阐明该响应背后的调控和代谢动态，为GlcNAc响应性调控提供见解，并凸显其作为增强稀有放线菌次级代谢产物生产诱导策略的潜力。
**主要关键技术方法**
研究人员以*Actinokineospora bangkokensis* 44EHWT（DSM 46700T = NBRC 108932T = TBRC 2203T）为研究对象，在ISP2培养基中添加50 mM GlcNAc进行培养，以ISP2为对照，每种条件五个重复制备粗提物。采用纸片扩散法（disk diffusion assay）检测粗提物对*Colletotrichum gloeosporioides* DoA c1060、*C. gloeosporioides* DoA c2434、*Fusarium oxysporum* DoA c0761和*Phytophthora palmivora* TrP04的抗真菌活性。通过HPLC分析和分级分离检测代谢物谱变化。对GlcNAc补充和未补充的5天龄液体培养物（三重复）进行RNA提取和Illumina测序，开展转录组分析。利用RAST、antiSMASH 8.0.4、TYGS等工具进行基因组挖掘和BGC预测。采用LC-MS/MS（Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪）进行非靶向代谢组学分析，通过MZmine 4、GNPS分子网络、SIRIUS/CANOPUS、MetaboAnalyst 6.0等平台进行数据处理、去重复、注释和统计分析。真菌指示菌株购自泰国农业与合作部农业部，*P. palmivora* TrP04由Mahidol大学理学院植物科学系Wisuwat Songnuam博士惠赠。
**研究结果**
**GlcNAc利用相关基因的基因组挖掘**：*A. bangkokensis* 44EHWT草案基因组跨7.5 Mb，由32个scaffold组成。基于基因组数据的系统发育关系表明该菌株与*A. spheciospongiae* EG49、*A. mzabensis* CECT8578和*A. pegani* TRM65233聚类。RAST注释显示6605个编码序列（CDSs）中1134个（18%）被分配至子系统特征，最丰富的五个功能类别为氨基酸及其衍生物（21%）、碳水化合物（13%）、蛋白质代谢（11%）、脂肪酸/脂质/类异戊二烯（10%）和辅因子/维生素/辅基/色素（10%）。基因组注释进一步鉴定出多个与GlcNAc摄取和分解代谢相关的基因，包括五个*glmS*同源物、一个*nagA*、两个*nagC*和四个*nagZ*基因。在碳水化合物类别的几丁质氨基糖亚类中，预测的GlcNAc利用转录调控因子属于GntR家族，在基因组中鉴定出两个基因座，长度分别为750 bp和762 bp。BLASTX分析显示，scaffold 17上的序列与*Amycolatopsis*属GntR家族转录调控因子具有中等相似性（73.49%–76.42%一致性），而scaffold 5上的基因与其他*Actinokineospora*物种序列具有高相似性（90.00%–100.00%一致性）。antiSMASH鉴定出共35个BGCs，包括9个PKS簇、9个杂合簇、5个RiPP簇、5个其他类别簇、4个萜烯簇和3个NRPS簇。比较基因组织分析表明thailandin BGC对应基因组区域9.2，归类为T1PKS簇。跨平台比较（antiSMASH、PRISM预测26个簇、ARTS预测31个簇）在簇边界和核心生物合成机制上完全一致。
**GlcNAc利用相关差异表达基因**：在检测到的6417个转录本中，6349个为蛋白质编码，其余为非编码RNA。GlcNAc补充下共2577个基因差异表达（log?FC ≥1且padj < 0.05），其中1287个（49.94%）上调，1290个（50.06%）下调。上调基因的log?FC范围为5.25至9.90，下调基因范围为5.60至8.16。在GlcNAc存在下，酮脂酰-ACP合酶III家族蛋白表达增加超过32倍，该酶参与脂肪酸生物合成，为聚酮、脂基抗生素和其他次级代谢产物提供前体。precorrin-6A合酶在代谢物生物合成中起关键作用，促进钴胺素形成。在调控和信号系统中，含GAF结构域的传感器组氨酸激酶表达相对于对照下降超过181倍，该蛋白在双组分信号系统中发挥功能，其下调提示可能作为生物合成途径的负调控因子。细胞色素P450酶表现出上调和下调。ABC转运蛋白ATP结合蛋白的一个异构型可能上调以促进分泌或降低细胞内毒性，而另一个参与底物输入或回收的异构型可能下调。在GlcNAc代谢途径中，一个*glmS*拷贝（编码葡萄糖胺-6-磷酸合酶）显著下调，而其余四个旁系同源物仅显示未达统计显著性的轻微波动。相反，*nagA*（N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脱乙酰酶）显著上调，而两个*nagZ*拷贝（β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶）均显著下调。在调控类别中，两个注释为GntR家族转录调控因子的序列显示出不同的表达模式，但仅一个表现出统计学显著变化。对35个注释BGCs的转录变化分析显示，GlcNAc补充并未均匀影响所有簇。若干BGCs（尤其是杂合类别以及选定的NRPS和PKS簇）核心生物合成基因呈现负log?FC值。相反，一部分簇显示显著上调，log?FC值超过2–6。按BGC类型分类，大多数PKS簇表现出适度或非显著变化，然而区域16.2（PKS样/I型PKS）显示核心和转运相关基因的强诱导，区域19.1显示核心和调控基因的协调上调。此外，区域9.2中的thailandin BGC在所有基因类别中均下调。在NRPS簇中，区域11.3显示核心基因下调伴随转运相关基因上调。杂合BGCs主要表现抑制，特别是区域9.5（I型PKS–寡糖）显示核心、转运和额外生物合成基因的协调下调。相反，区域31.2（II型PKS–ectoine杂合）显示核心、调控、转运和额外生物合成基因的协调上调。
**N-乙酰氨基葡萄糖对次级代谢产物生产和抗炭疽病活性的影响**：在ISP2培养基中补充50 mM GlcNAc培养的44EHWT发酵液比ISP2培养基培养物呈现更深的颜色。GlcNAc显著增强44EHWT粗提物产量25.92%，从517 ± 112.12 mg/L增至651 ± 69.59 mg/L。尽管两种条件下的HPLC色谱图相似，GlcNAc添加诱导了代谢物生产。thailandin B峰（RT = 11.94 min）大幅增加，并在RT = 12.61 min检测到新峰。五个重复的HPLC色谱图一致显示GlcNAc补充下的代谢物诱导。纸片扩散法结果显示，补充GlcNAc的44EHWT粗提物对植物病原菌产生比ISP2培养基更大的抑制圈。ISP2 + GlcNAc粗提物对大多数指示真菌表现出广谱活性，但*P. palmivora* TrP04除外。含GlcNAc的粗提物对*C. gloeosporioides* DoA c1060抑制圈最大（22.31 ± 0.5 mm），其次为*C. gloeosporioides* DoA c2434（20.42 ± 0.54 mm）和*F. oxysporum*（17.06 ± 0.08 mm）。更高的抗真菌活性与更大的thailandin B峰及含GlcNAc培养基获得的粗提物量增加相一致。比生长速率从ISP2中的3.3726 day?1略降至ISP2 + GlcNAc中的3.1589 day?1，表明在所测条件下GlcNAc对细菌生长影响轻微。培养形态观察显示可见表型变化为比未补充培养物更深的发酵液颜色。
**A. bangkokensis 44EHWT的非靶向代谢组学分析**：PCA结果显示第一和第二主成分分别解释58.9%和8.1%的方差，组间差异显著（p = 0.009，基于99次置换）。44EHWT粗提物在两种条件下共产生2705种代谢物，共享2097种共同化合物。ISP2补充50 mM GlcNAc诱导44EHWT产生493种先前未报道的代谢物特征，而ISP2有115种特异性代谢物。在GlcNAc补充的ISP2中479种独特代谢物中，402种未注释。已注释代谢物的主要部分（170种化合物）分类为氨基酸和肽类，归入寡肽（142种化合物），其中环肽（119种化合物）为主导亚类。其他肽类包括depsipeptides（5）、线性肽（4）、脂肽（6）、三肽（17）、二肽（17）和氨基酸（1）。此外，ISP2 + GlcNAc条件下检测到的其他代谢物类别包括脂肪酸（23种化合物）、脂肪酰胺（15）、生物碱（5）、聚酮（4）、萜类（4）和甘油磷脂（4），以及少量亚类如大环内酯、鞘脂、色氨酸生物碱和各种萜类衍生物。相反，未补充GlcNAc的ISP2培养物产生较少独特代谢物（115种化合物），主要与初级代谢和简单次级代谢产物相关。基于特征的分子网络揭示来自ISP2和ISP2 + GlcNAc的2705个节点（代谢物），分类为131个簇，3088条边和1489个单例。代谢物使用SIRIUS软件中的CANOPUS分类为天然产物类别，大多数代谢物分类为环肽（32.85%），其次为二肽（7.25%）和N-酰基胺（6.89%）。这些代谢物在置信水平3注释，因为代谢物被分配至多数置信评分> 0.7的化合物类别，但未确定其精确结构或氨基酸序列。由于产量不足以获得足够材料，纯化和表征环肽的尝试未成功，因此这些化合物仍为推定的环肽注释，需要进一步结构研究。基于ANOVA结果的前100个代谢物特征生成热图，结果显示所有高丰度代谢物均来源于GlcNAc补充。最受诱导的化合物为环肽，其次为二肽和简单吲哚生物碱，与分子网络中常见的代谢物分类一致。尽管基因组挖掘鉴定出35个BGCs，但基于现有基因组挖掘和代谢组学结果，仅两个可与抗真菌活性关联。在代谢组学分析中，Dereplicator+推定鉴定出nystatin，然而antiSMASH仅鉴定出一个核心生物合成基因与nystatin样*Pseudonocardia* polyene A1 BGC相似，该BGC包含四个核心生物合成基因，因此基因组证据不能确定完整nystatin生物合成途径的存在。分子网络突出显示一个polyene macrolide簇，包含两种条件下分布的共享代谢物，母体质量范围为537.3206–771.4157 m/z，保留时间为7.98–10.90 min，该簇包括两种thailandins。单变量统计分析显示ISP2 + GlcNAc中thailandin B水平显著增加，倍数变化为2.004，p = 3.1 × 10??。相反，thailandin A仅显示相对丰度的适度变化（倍数变化 = 1.105，padj = 0.390），未达统计学显著性。因此，GlcNAc补充导致两种相关thailandin代谢物的差异响应，thailandin B显著增加而thailandin A无统计学显著变化。Thailandin B经纯化并测试抗炭疽病活性，结果显示其对*C. gloeosporioides* DoA c1060产生14.36 ± 0.05 mm的抑制圈。四环素在所测条件下对*C. gloeosporioides* DoA c1060未显示抑制圈，而两性霉素B产生14.71 ± 0.95 mm的抑制圈，表明thailandin B的抗真菌活性在所测条件下与两性霉素B相当。
**讨论与结论**
研究人员通过整合转录组学和代谢组学方法探究GlcNAc对*A. bangkokensis* 44EHWT次级代谢的调控作用，观察到GlcNAc补充在代谢途径和BGCs中诱导协调但非均匀的响应。GlcNAc并非作为全局激活因子，而是引发簇特异性转录变化和选择性代谢物生产，提示环境依赖性调控作用。研究发现与GlcNAc作为代谢信号以时间和簇特异性方式调节次级代谢的作用一致。研究人员提出一个模型：细胞外GlcNAc被摄取进入细胞（最常见通过NagE等磷酸转移酶系统转运蛋白），转化为GlcNAc-6-磷酸，随后由NagA加工生成葡萄糖胺-6-磷酸（GlcN-6-P），后者已被提出在放线菌中作为信号分子发挥作用。随着细胞内GlcN-6-P积累，DasR介导的抑制可能被解除，导致参与GlcNAc利用的基因表达增加，并在某些情境下增加次级代谢。同时，GlcN-6-P可由NagB进一步转化为果糖-6-磷酸，从而将GlcNAc代谢与中央碳途径连接。进入糖酵解可能有助于碳流重新分布并增加关键生物合成前体（如乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A）的可用性，这些前体是聚酮合酶和非核糖体肽合成酶所需的。有趣的是，一个GntR调控因子在响应GlcNAc时表现出显著转录调节，而第二个GntR调控因子的mRNA水平基本未变，提示第二个调控因子可能以基础水平组成型表达以持续监测代谢，或其活性可能通过与小分子GlcNAc中间体（如GlcNAc-6-磷酸）的变构相互作用在翻译后水平受到调控。通过local tBLASTn使用参考*Streptomyces coelicolor* A3(2)蛋白NagE2和NagB进行靶向手动 curation，未在44EHW草案组装中检索到任一蛋白的序列命中，两种经典基因的确定性缺失反驳了组装碎片化伪影，强烈提示44EHW采用替代非PTS转运系统以及 divergent 或非经典脱氨酶机制驱动GlcNAc分解代谢和次级代谢产物增强。观察到的GlcNAc相关代谢基因表达模式表明采样时细胞内加工活跃，*nagA*上调支持GlcNAc-6-磷酸的持续转化，而*nagZ*下调（通常与聚合GlcNAc周转相关）与直接补充单体GlcNAc一致。五个*glmS*旁系同源物之一在GlcNAc补充下显著下调，由于*glmS*编码葡萄糖胺-6-磷酸合酶，催化从果糖-6-磷酸形成GlcN-6-P，其选择性抑制可能反映对来自外源GlcNAc的细胞内GlcN-6-P升高的反馈调控。在次级代谢水平，GlcNAc引发BGCs的异质性转录响应，表明调控重编程而非均匀激活。若干簇显示核心生物合成基因与辅助元件之间的不一致表达模式，提示途径内异步或模块化调控。分子网络和多变量分析进一步揭示GlcNAc补充并未诱导次级代谢产物生产的全局增加，而是选择性增强特定代谢物簇，支持GlcNAc主要作为调控信号而非仅作为辅助碳源发挥作用的观点。基因组注释和转录组分析鉴定出GlcNAc响应性调控因子，包括GntR家族成员，与放线菌中已建立的模型一致。然而，仅基于序列注释无法确定所鉴定的GntR家族调控因子即为DasR，因此增强的thailandin B生产不能直接归因于DasR介导的调控。粗提物的抗真菌活性使用等体积提取物评估，尽管该方法允许在相同测定条件下比较，但未根据生物量、总提取物质量或thailandin B浓度归一化样品，因此GlcNAc补充培养物获得的更高粗提物产量可能部分 contributed to 更大的抑制圈。然而，GlcNAc补充培养物中略降低的比生长速率，连同改变的代谢物谱和增强的thailandin B生产，提示增加的抗真菌活性至少部分与GlcNAc诱导的次级代谢产物生产变化相关，而非仅仅增加细菌生长。本研究中鉴定的493种独特代谢物代表进一步天然产物发现的有前景资源。推定的环肽代谢物也基于其在ISP2 + GlcNAc条件下丰富的特征和有前景的生物活性被选为进一步研究，然而其产量不足以成功纯化和结构表征。GlcNAc补充下环肽优先于聚酮增强源于GlcNAc作为含氮碳源的化学性质。通过NagA和NagB酶切GlcNAc产生果糖-6-磷酸同时释放游离铵，直接为中央氮代谢提供燃料并扩大非核糖体肽合成酶组装线所需的细胞内氨基酸池。相反，聚酮合酶途径严格依赖酰基辅酶A碳骨架，不直接受益于氮通量增加。此外，DasR去抑制与全局氮调控级联之间的交叉对话信号碳和氮充足，选择性激活氮需求型BGCs如环肽。在收获时间点观察到代谢物积累与某些核心生物合成基因转录之间的反向关系，特别是thailandin BGC在第5天下调 despite 持续高水平的thailandin生产，这种明显差异提示转录活性与代谢物输出之间的时间解耦。一种合理解释是转录在较早生长阶段达到峰值，产生足够池的生物合成酶（特别是PKS复合物），即使在转录衰减后仍保持催化活性。此外，thailandin或其中间体的积累可能触发负反馈调控，一旦达到足够代谢物浓度即减少进一步转录。前体供应基因如*nagA*的持续上调可能确保乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A的持续可用性，从而支持持续的酶活性 despite 簇转录降低。GlcNAc补充后thailandin B相对丰度的显著增加 compared with thailandin A的响应，可能与生物合成途径的组织和调控有关。Thailandin B已被提出为thailandin A的直接生物合成前体，后者通过随后的鼠李糖基化步骤生成。GlcNAc补充可能优先增强涉及thailandin B组装的上游生物合成过程，从而增加上游生物合成通量，而下游鼠李糖基化步骤可能未同等增强。这种差异响应可能潜在由有限的糖基转移酶活性、活化的糖供体dTDP-鼠李糖可用性不足或参与糖生物合成和转移的基因诱导较弱所致，从而有利于thailandin B相对于完全糖基化产物的积累。本研究展示了GlcNAc作为有效化学诱导剂调控*A. bangkokensis* 44EHWT次级代谢产物生产的潜力。基因组挖掘揭示若干BGCs和GlcNAc相关调控框架，为营养响应性途径调控提供了遗传基础。GlcNAc补充通过增加粗提物产量、改变代谢物谱和改善抗真菌活性显著增强次级代谢产物生产。此外，GlcNAc提升thailandin B和环肽的产量，导致生物活性增加，表明GlcNAc介导的代谢重塑直接有助于代谢物功效。转录组分析揭示BGCs间的异质性调控，支持GlcNAc作为调控信号而非仅仅碳源的作用。非靶向代谢组学进一步证实众多 largely uncharacterized 代谢物的选择性诱导，凸显该方法扩展化学多样性的能力。总体而言，本工作采用多组学框架阐明44EHWT中GlcNAc响应性次级代谢，结果确立GlcNAc补充作为选择性增强目标次级代谢产物途径的实用策略，将该菌株定位为天然产物发现和生物技术应用的有前景的微生物细胞工厂。
