《Biomass》：The Bark of Abies alba as a Source of Phenolic Compounds: Optimization of Deep Eutectic Solvent and Microwave-Assisted Deep Eutectic Solvent Extraction Processes
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冷杉（Abies alba）树皮是一种丰富的林业副产物，作为酚类化合物的可再生来源具有相当大的潜力。本研究采用葡萄糖/乳酸（1:3）低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）作为可持续提取介质，研究了冷杉树皮中酚类化合物的提取工艺。研究人
冷杉（Abies alba）树皮是一种丰富的林业副产物，作为酚类化合物的可再生来源具有相当大的潜力。本研究采用葡萄糖/乳酸（1:3）低共熔溶剂（deep eutectic solvent，DES）作为可持续提取介质，研究了冷杉树皮中酚类化合物的提取工艺。研究人员通过设计实验（planned experiment），评估提取温度和提取时间的影响，对提取条件进行了优化。DES提取的提取效率（extraction efficiency）为6.00%–10.46%，总酚含量（total phenolic content，TPC）为120.43–338.09 mg GAE/g提取物，自由基清除活性（radical scavenging activity，RSA）为54.06%–77.11%。微波辅助DES提取（microwave-assisted extraction with DES，MAE-DES）将提取时间从60–180 min缩短至1–30 min，提取效率为3.94%–7.75%，总酚含量为14.44–282.14 mg GAE/g提取物，自由基清除活性为34.71%–97.71%。尽管常规提取通常获得更高的提取效率和总酚含量，但微波辅助提取实现了更高的自由基清除活性，并大幅缩短了提取过程。鉴定出的酚类化合物包括原花青素（procyanidins）、儿茶素（catechin）、花旗松素（taxifolin）、没食子酸（gallic acid）和香草酸（vanillic acid）。葡萄糖/乳酸DES代表了一种有前景的绿色溶剂，可用于冷杉树皮的增值利用以及从森林生物质中可持续回收具有生物活性的酚类化合物。
论文解读
一、研究背景与意义
森林采伐和工业木材加工过程中会产生大量树皮残渣。传统上，树皮多被用于燃烧或土壤改良等低价值用途。随着循环生物经济理念的推广，将残余生物质转化为有价值的材料和生物活性化合物日益受到关注。树皮作为化学组成复杂的木质纤维素基质，含有大量抽提物，尤其是酚类化合物，这些化合物参与植物防御机制并具有抗氧化及其他生物活性。因此，从树皮中回收生物活性成分是提高森林生物质利用可持续性和经济价值的重要策略。
冷杉（Abies alba）是欧洲森林中最重要的本土针叶树种之一。其树皮含有复杂的抽提物混合物，包括酚酸、黄酮类、鞣质、木脂素及其他次级代谢产物。这些成分因具有抗氧化、抗菌等生物活性而受到越来越多的关注。然而，以往对冷杉树皮的研究主要集中于亚临界水提取、超声辅助提取和加速溶剂提取等已建立的绿色提取技术。关于基于碳水化合物的低共熔溶剂（DES），特别是葡萄糖/乳酸型DES及其与微波辅助提取（MAE）联用的研究仍然有限。此外，提取参数对提取率、总酚含量、抗氧化活性及酚类组成的影响尚未通过设计实验进行系统优化。
葡萄糖/乳酸型DES体系因其可生物降解性、可再生来源以及形成广泛氢键网络的能力而具有特别的吸引力，这种氢键网络可以增强极性酚类化合物的提取。将DES与微波辅助提取相结合代表了一种过程强化手段，微波辐照通过偶极旋转和离子传导实现快速体积加热，从而在保持或改善目标生物活性化合物回收率的同时缩短提取时间。因此，基于碳水化合物的DES与MAE的结合代表了森林工业产生的冷杉树皮残渣增值利用的一种有前景的策略。
本研究的主要创新点体现在三个方面：第一，首次对该DES体系用于冷杉树皮进行了系统的多响应建模，将溶剂物理化学性质（黏度和密度）随温度的变化与提取率、总酚含量和抗氧化活性相关联；第二，常规热DES提取与微波辅助DES提取（MAE-DES）的直接对比分析揭示了提取选择性的转变；第三，揭示了加热模式与特定多酚标志物回收之间的权衡关系。
二、主要技术方法
研究人员采用五水平双因素设计实验（planned experiment）系统研究提取温度和提取时间对冷杉树皮酚类化合物回收的影响。实验设计包括4个因子点、4个轴向点和5个中心点重复，共13组实验。常规DES提取的温度范围为30–100 °C，时间范围为60–180 min；MAE-DES提取的时间范围为1–30 min。生物质与DES的质量比固定为1:10。常规提取在热风烘箱中进行，MAE则在Milestone ETHOS 1微波系统中进行。提取率（YE）通过重量法测定，总酚含量（TPC）采用Folin–Ciocalteu比色法测定，抗氧化活性通过DPPH自由基清除活性（RSA）测定，酚类组成采用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）进行定性和定量分析。数据通过方差分析（ANOVA）和二次回归模型进行统计评估。
三、研究结果
3.1 DES的表征
葡萄糖/乳酸DES（1:3）的黏度随温度升高呈非线性显著下降，30–50 °C区间下降最为剧烈，之后逐渐趋于稳定。这一行为归因于温度升高导致氢键相互作用减弱和DES分子流动性增加。相比之下，该DES的密度在研究的温度范围内仅略有下降，呈近似线性递减，反映了液体的热膨胀，而变化的幅度较小则表明DES结构内存在强分子间相互作用。该DES在27.5 °C下的折射率为1.46。
3.2 DES提取的提取率评估
13组实验条件下，冷杉树皮DES提取的提取率（YE）在6.00%–10.46%之间变化。最高YE在实验6（10.46%）中获得，其次是实验4（9.86%）和实验2（9.63%）。最低YE出现在实验7（6.00%）、实验13（6.08%）和实验9（6.37%）。最大YE比最小YE高出约74%，凸显了优化提取参数的重要性。方差分析确认了所建立的二次数学模型对YE具有较高的准确性和统计充分性。温度（b?=0.0138）和时间（b?=0.0048）的线性效应及其二次项均显著提高YE，其中温度是最具影响力的变量，而温度与时间的交互项不显著。
3.3 总酚含量分析
冷杉树皮DES提取的总酚含量（TPC）在120.43–338.09 mg GAE/g提取物之间变化。最高TPC在实验6（338.09 mg GAE/g提取物）中测得，实验4（335.40 mg GAE/g提取物）紧随其后。最低TPC出现在实验3（120.43 mg GAE/g提取物），这归因于低温下DES的高黏度和受限的传质。中心点重复实验显示出高度可重复性。统计模型R2=0.9164，p=0.0012。提取温度（b?=72.69）是主导线性因子，单独的时间效应不显著，但温度-时间交互项（b??=33.10）具有统计学显著性，表明升高温度降低溶剂黏度并增强传质，使延长提取时间对最大化酚类回收有效。
3.4 抗氧化活性测定
13组实验的RSA值在54.06%–77.11%之间，平均值为66.44±6.72%。最高RSA在实验6（77.11%）中观察到，最低值在实验5（54.06%）中获得。大多数实验运行的RSA值高于60%。回归模型的R2=0.9255，整体模型F值为9.94，p=0.0204。线性项（s?）影响最为显著（F=23.98），而二次项和交互项均不显著。在个体回归系数中，仅线性系数b?（0.0761）具有统计学显著性，表明温度是影响RSA的主要因素。
3.5 微波辅助DES提取
MAE-DES提取中，YE范围为3.94%–7.75%，最高YE在实验4（7.75%）中获得。TPC波动最为显著，范围从14.44到282.14 mg GAE/g提取物，最高酚类回收在实验6（282.14 mg GAE/g提取物）中获得。RSA在34.71%–97.71%之间变化，最高RSA在实验1（97.71%）中记录。值得注意的是，实验1虽然TPC（25.90 mg GAE/g提取物）和YE（3.94%）较低，但RSA值最高，这可能表明优先提取了强效的个别抗氧化化合物。
YE的数学模型R2=0.9656，p=0.0055，温度和时间的线性系数均显著，表明升高温度和延长微波辐照时间可同时提高提取率。TPC模型R2=0.9818，p=0.0016，温度是主导因素（b?=103.20），而提取时间不显著，表明在MAE-DES条件下酚类传质相对较快地达到平衡。RSA模型的R2=0.8633，整体p值（0.0709）略高于显著性阈值，但温度的二次项系数（b??=0.1686）显著，表明温度对RSA存在非线性贡献。
3.6 HPLC-DAD酚类化合物鉴定
常规DES提取中，儿茶素和原花青素的回收高度依赖于提取条件，两者在实验6（100 °C，120 min）达到峰值，儿茶素最大浓度为16.3 mg CA/g提取物，原花青素为34.1 mg PA/g提取物。MAE-DES在实验6（100 °C，15.5 min）中获得了最高的原花青素含量（54.1 mg PA/g提取物），比相同温度下常规加热高出58.5%，而提取时间从120 min缩短至15.5 min。然而，MAE-DES条件下儿茶素回收在所有实验运行中均较低，最大仅为2.2 mg CA/g提取物。
常规加热的统计模型显示，儿茶素的提取主要由温度驱动，线性温度项（b?=1.6985）和二次温度项（b??=2.0570）均显著，而线性时间因子（b?=?1.1982）呈显著负效应。原花青素的提取中，温度呈现最强的正向影响（b?=1717.2448），且温度与时间之间存在显著的协同交互作用（b??=814.9500）。相比之下，MAE-DES中儿茶素仅线性温度系数（b?=0.4751）显著，而原花青素的模型整体不显著（R2=0.571，p=0.4712），表明在所研究的范围内原花青素含量不能归因于温度或提取时间的变化。
在最佳常规加热条件（100 °C，120 min）下，DES实现了单体和低聚黄酮类及酚酸的均衡提取，原花青素达34.15 mg/g提取物，儿茶素为16.36 mg/g提取物，同时保留了花旗松素（6.80 mg/g提取物）和阿魏酸（1.22 mg/g提取物）。MAE-DES（100 °C，15.5 min）则使原花青素含量提高至54.14 mg/g提取物（比常规加热高58.5%），但儿茶素含量下降约85.9%至2.30 mg/g提取物，花旗松素下降72.8%至1.85 mg/g提取物，阿魏酸未检出，而检测到香草酸（0.98 mg/g提取物）。
四、讨论与结论
讨论部分指出，DES提取的提取率和酚类回收对提取温度具有显著依赖性，这与DES的物理化学特性密切相关。DES通常具有较高黏度，限制溶剂与固体生物质之间的传质，升高温度可降低溶剂黏度，改善溶剂在木质纤维素基质中的渗透和扩散。MAE-DES的主要优势并非普遍提高提取效率，而是显著改变提取选择性，能够在极短时间内富集原花青素。常规加热更适合同时回收单体和低聚酚类化合物，尤其是儿茶素和原花青素。TPC与RSA之间的关系表明，TPC单独不足以描述提取物的功能质量，RSA受提取物定性组成和个别高活性化合物的相对贡献影响。
研究结论表明，使用葡萄糖/乳酸（1:3）DES从冷杉树皮中回收酚类化合物是可行的。提取性能受温度强烈影响，而提取时间的影响取决于加热模式和所考虑的响应指标。常规DES提取的YE为6.00%–10.46%，TPC为120.43–338.09 mg GAE/g提取物，温度是控制酚类回收的主要因素。MAE-DES大幅缩短了提取时间，对YE和TPC均表现出较高的预测性能，其最大优势在于显著改变提取选择性。MAE-DES在100 °C下15.5 min可获得54.14 mg/g提取物的原花青素浓度，比相同温度下常规加热高约58.5%；而常规DES提取在100 °C下120 min更适合儿茶素回收，达16.36 mg/g提取物。两种加热模式获得的不同提取谱图表明，工艺优化应基于回收生物质组分的预期价值，而非仅依据提取率。由于最有利条件位于实验域边界或附近，未来研究应扩展温度范围并进行预测最优条件的实验验证，同时关注DES回收利用、工艺放大、能耗评估、提取物纯化和全面化学表征等方面。
