番茄残渣衍生荧光与生物活性碳点（CDs）的绿色水热合成及合成参数对光物理与生物学性能的调控

《Applied Nano》：Green Synthesis of Fluorescent and Bioactive Carbon Dots Derived from Agri-Food Industry Waste

　　

研究人员以番茄残渣（TR）为原料，通过水热碳化（HTC）合成了荧光氮掺杂碳点（TRCDs），并考察了温度、反应时间、氮前体以及乙二胺/番茄残渣（EDA/TR）质量比等参数对其光物理与生物学性质的影响。最优合成条件为250 °C、6 h、EDA/TR质量比0.08，水相碳点级分收率为17.6%（w/w）。TRCDs表现出强蓝色荧光，在460 nm发射波长下荧光量子产率为0.17。原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）分析显示，所得颗粒为分散良好的准球形纳米颗粒，尺寸符合碳点特征。由不同添加剂制备的TRCDs在ABTS^•+（2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基阳离子）和DPPH^•（2,2-二苯基-1-苦基肼自由基）实验中均表现出抗氧化活性，分别高达969和75 μg Trolox当量（TE）/mg TRCDs。细胞毒性研究表明，在所有测试细胞系中，浓度高达500 μg/mL时细胞活力仍高于80%；VERO（非洲绿猴肾上皮细胞）在浓度高达2000 μg/mL时细胞活力高于90%；荧光显微镜显示TRCD暴露后出现细胞相关荧光，支持其作为荧光细胞标记物的潜在应用。

研究背景与意义：农业食品工业是重要经济部门，也是环境废物的重要来源。全球约三分之一的食品被损失或浪费，相当于每年13亿吨，其中加工残余物占相当比例；这些残余物进入填埋场会增加温室气体排放，处置不当还可造成土壤和水体污染。向循环生物经济转型促使研究人员关注这类废物流的增值利用，因为农业食品残余物富含生物活性化合物和富碳分子，可作为高值产品前体。番茄加工行业尤为突出：全球每年生产超过1.8亿吨番茄，约4000万吨进入加工，产生数百万吨由果皮、种子和果肉组成的番茄渣副产物。该残余物增值与联合国可持续发展目标（SDGs）2、9、12和13相一致。碳点（CDs，carbon dots）是典型直径1–10 nm的准球形碳纳米颗粒，2004年发现以来因发光可调、量子产率高、光稳定性好、表面易功能化及水溶性好而受到关注，已用于传感、催化、环境修复、能源以及生物传感、生物成像、药物递送、抗菌和抗氧化等。由农业工业废物合成CDs通常采用水热碳化（HTC，hydrothermal carbonization），该单步自下而上方法简单、可扩展且环境负担较低。研究人员已探索软木蒸煮废水、橄榄厂废物、废弃咖啡渣和微藻等前体，并将该方法扩展到番茄渣，通过微波辅助HTC制备荧光生物活性CDs。为促进废物增值和循环经济目标，本研究采用简单可持续的HTC由TR合成CDs，系统探索反应参数，并评估其抗氧化性、细胞毒性及细胞荧光标记潜力。

主要关键技术方法：以TR为碳源，采用高压HTC，考察温度、时间、氮前体和EDA/TR质量比等参数；结合红外光谱、核磁共振、质谱、元素分析、zeta电位（ζ电位）、原子力与透射电子显微及透析分级表征结构与形貌；用紫外-可见吸收、稳态荧光和时间分辨荧光测定光物理性质；用自由基清除实验评价抗氧化能力；用噻唑蓝（MTT）法检测细胞活力，并以荧光显微镜观察细胞相关荧光。细胞系来源：VERO E6 ATCC? CCL-81与S180 ATCC? TIB-66购自CLS Cell Lines Service（现Cytion）；NIH-3T3 ATCC? CRL-1658与HeLa ATCC? CCL-2经BEI Resources, NIAID, NIH获得。

研究结果：
3.1 碳点合成（Synthesis of TRCDs）
研究人员通过高压反应器HTC，系统改变碳化温度、停留时间、添加剂种类与负载及气氛，发现温度由250 °C升至300 °C时质量收率由20.2%降至10.5%，而荧光量子产率（QY，fluorescence quantum yield）基本不变；反应时间由4 h延长至8 h时QY基本恒定（0.14–0.15），较长时间下质量收率略降；胺类添加剂提高质量收率和荧光性能，其中EDA的QY最高（0.15），二乙烯三胺（DETA，diethylenetriamine）质量收率最高（28.0%），芳香胺如三聚氰胺（melamine）和对苯二胺（p-PD，p-phenylenediamine）或尿素（urea）所得QY较低。EDA/TR质量比呈高斯型依赖，0.08时QY最大（0.17）；更高比例虽使质量收率增至55.9%，但荧光效率下降。N₂与空气条件下QY和质量收率无显著差异。据此选择250 °C、6 h、EDA/TR=0.08，所得TRCDs-XII收率为17.6%（w/w），不溶残渣13.2%，有机提取物4.9%，总收率18.1%。结论是该条件在质量收率与荧光性能之间取得折中。

3.2 结构与形貌表征（Structural and Morphologic Characterization of TRCDs）
通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，Fourier transform infrared spectroscopy）、¹H核磁共振（¹H NMR，proton nuclear magnetic resonance）和基质辅助激光解吸电离-电喷雾电离质谱（MALDI-ESI-MS，matrix-assisted laser desorption ionization-electrospray ionization mass spectrometry）等表征，FTIR显示O-H、N-H、C=O、C=N、C-O等基团，增加EDA可增强羧酸/羧酸盐、酰胺及O-H/N-H谱带；¹H NMR显示脂肪族C-H、CH-O和CH-N环境及弱芳香质子信号；MALDI-ESI-MS主要出现m/z 530–625的含氮低至中等分子量结构。元素分析为C 53.86%、H 5.22%、N 8.14%、O 24.48%、S 0.00%，灰分8.30%，C/N比6.62。AFM和TEM显示准球形纳米颗粒，高度1.2–3.2 nm，TEM平均横向尺寸3–5 nm，多数低于8 nm。透析实验中第一透析液占初始质量50.3%、QY为0.14，最终截留物QY仅0.012、占3.4%质量，累计透析液回收88.1%，提示发光与<1 kDa的低至中等分子量物种相关。透析样MALDI-ESI-MS出现较高m/z 650–920，AFM高度2–18 nm，TEM平均5–6 nm。ζ电位在EDA/TR=0.08、pH 9.17时为?4.9±0.6 mV；EDA/TR=0.32、pH 9.20时为?22.4±1.1 mV，透析后为?17.1±1.1 mV（pH 9.30）。结论是氮已掺入，AFM/TEM观察到的颗粒符合超分子组装模型，而非完全个体化纳米颗粒。

3.3 光物理性质（Photophysical Properties of TRCDs）
通过紫外-可见吸收（UV–Vis）、稳态荧光和时间相关单光子计数（TCSPC，time-correlated single-photon counting）研究，TRCDs吸收峰约在275和320 nm；λ_exc=380 nm时于460 nm发射蓝色荧光，激发谱约370 nm；p-PD功能化使最大发射红移至约470 nm并伴510 nm肩峰；发射随激发波长340–440 nm变化而红移，归因于样品异质性和光带隙分布；QY为0.17；0.1 mg/mL溶液在380 nm连续照射1 h后荧光强度不下降；pH 1–8范围内荧光基本稳定，pH>8至12逐渐降低但仍可检测。TCSPC衰减呈三指数：τ₁=5.03 ns（56.6%）、τ₂=12.23 ns（31.2%）、τ₃=1.02 ns（12.1%），τ_ave=6.79 ns（χ²=1.18）；透析样τ₁=5.63 ns（61.0%）、τ₂=13.66 ns（29.3%）、τ₃=0.92 ns（9.75%），τ_ave=7.52 ns（χ²=1.20）。结论是TRCDs具良好荧光、光稳定性和较宽pH稳定性，荧光寿命呈异质性。

3.4 抗氧化活性（Antioxidant Activity of TRCDs）
通过ABTS^•+（2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基阳离子）和DPPH^•（2,2-二苯基-1-苦基肼自由基）实验，ABTS^•+结果均高于DPPH^•；差异归因于介质（水缓冲体系与甲醇/水体系）、反应路径（单电子转移（SET，single electron transfer）与氢原子转移（HAT，hydrogen atom transfer））及空间位阻。三聚氰胺衍生TRCDs的ABTS^•+清除能力最高，为968.7±1.1 μg Trolox当量（TE）/mg TRCDs；无氮添加剂样品通常高于DETA、尿素、p-PD或EDA制备样品；EDA/TR由0.08增至0.32仅引起中等变化。TRCDs的ABTS^•+响应强于柠檬酸衍生CDs；透析降低ABTS^•+清除能力但不影响DPPH^•。半数抑制浓度（IC₅₀）在ABTS^•+实验为3.32±0.03 μg/mL，低于Trolox的5.90±0.11 μg/mL；在DPPH^•实验为1024.50±0.03 μg/mL。结论是TRCDs对ABTS^•+清除强、对DPPH^•较低，抗氧化性能受氮添加剂化学性质和纯化影响。

3.5 细胞毒性（Cytotoxicity of TRCDs）
通过MTT法在VERO（非洲绿猴肾上皮细胞）、NIH-3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）、S180（小鼠肉瘤细胞）和HeLa（人宫颈癌细胞）中检测，TRCDs-XII浓度0.5–4000 μg/mL作用18 h，以细胞活力降低>30%为毒性。VERO在至2000 μg/mL时无细胞毒性，NIH-3T3在至500 μg/mL时高于阈值；S180在1000 μg/mL时活力约59%（降低约41%），HeLa在2000 μg/mL时活力约66%（降低约34%）。透析样TRCDs-D与TRCDs的毒性谱不同且呈细胞系依赖；总体VERO最不敏感，HeLa最敏感。结论是TRCDs在较低浓度下具良好细胞相容性，肿瘤细胞更敏感。

3.6 体外细胞成像（In Vitro Cell Imaging）
通过荧光显微镜在500 μg/mL、18 h、37 °C条件下观察TRCDs-XII处理的四种细胞，未处理细胞为对照，采用蓝/紫外、蓝和绿激发，图像为定性且未作定量强度分析。VERO可见细胞相关荧光，主要位于胞质，核周较低；NIH-3T3细胞相关信号较低而细胞外荧光较高；S180信号更均匀，主要位于细胞周边；HeLa信号主要位于胞质，核周较少。由于常规荧光显微镜不能区分胞内摄取与细胞表面结合，也不能定位亚细胞结构，结果需膜或细胞器标记及共聚焦显微镜进一步确认。结论是TRCDs在非肿瘤和肿瘤细胞中产生可检测荧光，支持其作为荧光细胞标记物的潜力。

讨论部分总结：讨论围绕合成参数—结构—性能关系展开。温度主要影响质量收率，胺类前体和EDA/TR比例影响氮掺入与荧光效率；AFM/TEM尺寸与质谱分子量不一致，研究人员以超分子组装模型解释固态颗粒由低至中等分子量荧光团动态组装而成。抗氧化差异由ABTS^•+/DPPH^•反应机制、介质和空间位阻及添加剂化学性质解释，纯化影响不同自由基响应。细胞毒性和成像受细胞系影响，成像仅为定性证据。研究意义在于将番茄加工残余物转化为可调荧光、抗氧化且细胞相容性较好的CDs，服务于废物增值和循环生物经济。

研究结论部分翻译：在本工作中，研究人员利用可持续水热加热，以TR为碳源成功合成了CDs，揭示了一种增值丰富农业工业副产物的有效策略。所得TRCDs表现出可通过调节合成条件、氮前体和纯化方法设计的光化学与生物学性质。AFM和TEM形态学表征确认形成纳米级碳点，颗粒高度1.2–3.2 nm，平均横向尺寸3–5 nm。FTIR、NMR和MALDI-ESI-MS分析提供了对合成TRCDs结构特征和分子组成的认识，其光物理性质通过吸收和荧光技术评估，确认其作为荧光和光稳定纳米材料的性能。合成TRCDs在ABTS^•+和DPPH^•实验中显示抗氧化活性，分别高达969和75 μg TE/mg TRCDs。抗氧化性能受碳前体和氮添加剂化学性质影响，强调番茄废物作为抗氧化碳点可持续前体的潜力，并强调表面官能团在决定抗氧化性质中的重要性。结果表明，新型TRCDs具有良好细胞相容性，在所有测试动物和人类细胞系中高达500 μg/mL时细胞活力高于80%。荧光显微镜显示TRCD暴露后可检测到细胞相关荧光。这些发现突出TRCDs良好生物相容性，并支持其作为荧光细胞标记物的潜力。除本研究探索的生物应用外，TRCDs的潜在用途可进一步扩展；除已进行的体外细胞毒性评估外，还设想开展旨在评估TRCDs生物相容性的体内研究。