基于对寨卡病毒基因组在受限与未受限环境中RNA折叠行为的分子动力学模拟与邻近连接实验数据整合分析，揭示空间限制重塑RNA三维结构并促进基因组环化的物理机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：3D confinement reshapes RNA folding and enhances circularization in the Zika virus

　　

许多RNA分子在受限环境中发挥功能，但空间限制对RNA折叠的影响仍知之甚少。邻近连接实验揭示了受限与未受限状态下长程接触的改变，然而这些实验并不能解释空间约束如何导致这些差异。本研究开发了一种物理建模方法，将邻近连接数据整合到粗粒化分子动力学模拟中，以重建受限条件下的RNA三维结构。研究人员以寨卡病毒约11 kb基因组为模型，比较了病毒粒子内（受限）与细胞内（未受限）的折叠情况。研究发现，基因组两个区域之间接触概率与线性距离的关系在受限与未受限情况下遵循不同的标度律，这与邻近连接实验的结果一致。研究人员发现，基因组环化——一种调控寨卡病毒复制的相互作用——在受限条件下在实验和模拟中均更频繁地发生。该模型揭示了通过堆叠形成长双链茎区赋予RNA局部向列液晶序，并预测了与较短RNA晶体结构中所见一致的假结拓扑。这些结果为空间限制改变长RNA分子可及三维结构集合的机制提供了见解。

研究背景方面，RNA分子普遍存在于紧密受限的空间中，包括被蛋白质衣壳包裹的病毒基因组、相分离RNP颗粒内的mRNA和lncRNA、以及脂质纳米颗粒封装的RNA治疗药物。尽管此类系统广泛存在，目前尚无预测空间限制如何影响RNA折叠的通用框架。新兴实验和理论证据表明，空间限制可改变RNA的结构和功能。邻近连接实验检测到的长程相互作用频率和模式在细胞内与病毒粒子内的RNA病毒基因组之间存在差异，涉及寨卡病毒、SARS-CoV-2和HIV等。从热力学角度，空间限制增加排除体积相互作用并惩罚未折叠状态，从而扰动RNA能量景观并 favoring 紧凑构象。尽管RNA结构常通过物理和机器学习方法进行计算机模拟，但这些方法未将空间限制作为可调参数纳入，因此目前缺乏研究空间限制对RNA折叠影响的工具。研究人员通过数据驱动的聚合物建模框架填补了这一空白，该框架将邻近连接实验中的碱基配对接触频率与粗粒化分子动力学相结合，构建RNA折叠的三维模型，使研究人员能够模拟大型RNA的折叠并比较受限与未受限条件下的结构集合。研究聚焦于寨卡病毒基因组，因其在细胞内外均已被广泛通过邻近连接技术分析，且包含调控翻译与复制转换的环化基序以及稳定亚基因组RNA和抑制宿主RNAi先天免疫的假结等功能重要的RNA二级结构元件。

关键技术方法方面，研究人员开发了粗粒化分子动力学模型，将RNA表示为每个核苷酸一个珠子的珠簧聚合物，碱基对根据邻近性和从结构集合预测或实验数据衍生的接触概率表动态形成和断裂，配对区域具有更高的弯曲刚度以反映双链RNA的刚性，病毒粒子内的空间限制通过将聚合物限制在对应内衣壳体积的势能来建模。模型还包括碱基对堆叠的简化处理以促进长茎区形成。此外，研究人员采用了基于粗粒化结构的衣壳蛋白表示和静电相互作用模拟，以及基于属（genus）的假结拓扑表征方法。

研究结果方面，第一，实验接触模式与概率在限制条件下存在根本差异。研究人员重新分析寨卡病毒的COMRADES、SPLASH和PARIS邻近连接数据集，发现细胞内和体外重折叠RNA的接触图以局部相互作用为主，而病毒粒子来源的RNA表现出众多不同的长程接触。接触概率与基因组距离的标度分析显示，未受限状态（体内）的接触指数约为-1.27，接近理想链的-3/2，而受限状态（病毒粒子内）的接触指数约为-0.85，接近分形球团的-1。当前RNA二级结构预测算法无法重现这些结果，表明病毒粒子内的空间限制显著重塑了病毒基因组的折叠，需要不同的建模方法。第二，数据驱动的聚合物模型重现了限制对接触模式的影响。研究人员在LAMMPS中实现的粗粒化模型能够生成与实验相关性良好的接触图（未受限模拟Pearson相关系数0.709，受限模拟0.533），且接触概率曲线在受限与未受限条件下保持显著差异，后者与分形球团的c=1标度律一致。第三，堆叠导致物理上真实的RNA结构并形成多个假结。引入碱基对堆叠能量增益后，消除了键应变和茎区长度分布的问题，同时保留了与实验一致的碱基配对模式，模拟预测的假结属值接近寨卡基因组长度RNA的预期值。第四，折叠RNA分子表现出玻璃态和向列序。模拟显示碱基配对接触的动力学缓慢且持续相关，符合玻璃态行为，且未受限条件下的玻璃态更为显著，空间限制显著流化系统。长茎区赋予RNA局部取向序，向列畴特征长度约2-3 nm。第五，模拟和实验均表明限制条件下环化频率更高。环化接触在病毒粒子内的相对频率比体内高一个数量级以上，模拟中受限条件下约75%的环化碱基对存在，而未受限条件下降至不足1%。第六，纳入静电相互作用和衣壳蛋白可改善受限模拟的性能，引入衣壳蛋白的基于形状的粗粒化表示和静电相互作用后，模拟与实验数据的相关性提高（Pearson相关系数0.37 vs 0.33），提示成熟病毒粒子中衣壳蛋白至少部分保持与外层的附着。

讨论与结论部分，研究人员总结了邻近连接分析揭示的体内与病毒粒子条件下接触图的显著差异，指出病毒粒子内的接触概率与分形球团模型一致，而体内的接触概率衰减更陡，与随机游走一致。模拟表明物理约束足以解释标度行为的差异。研究人员讨论了模型的局限性，包括每个核苷酸一个珠子的表示无法采用A型螺旋几何，但模型参数基于文献数据具有真实性，预测的全局重塑、接触概率关系、假结普遍性和环化倾向具有稳健性。模拟还预测了堆叠促进2-3 nm小向列畴的形成，可能有助于防止病毒粒子内过度缠结，以及RNA接触的缓慢玻璃态动力学可能解释RNA为何不能在热力学上完全平衡从而在病毒粒子内折叠成分形球团。环化接触在病毒粒子内频率更高的结果得到实验和模拟的双重支持，具有功能重要性，因为这些接触决定病毒粒子释放到宿主后转录与翻译之间的平衡。模拟表明环化增强部分纯粹由于空间限制，部分由于分子末端核苷酸序列的特异性配对促进长茎区形成，这些接触定位在限制性衣壳表面附近，可能促进RNA进入细胞质后RNA结合蛋白的可及性。研究人员的方法补充了化学探测方法，计算建模技术为RNA二级结构重塑动力学提供了额外见解。研究结论为：邻近连接实验分析揭示了体内与病毒粒子条件下接触图的显著差异；病毒粒子内的接触概率与分形球团模型一致，体内接触概率衰减与随机游走一致；模拟表明物理约束足以解释标度行为差异；堆叠促进小向列畴形成；RNA接触呈现缓慢玻璃态动力学；环化接触在病毒粒子内频率显著高于体内条件，部分由于空间限制，部分由于末端核苷酸序列特异性配对促进长茎区形成。研究人员指出其研究RNA在有无限制条件下三维折叠的方法将广泛适用于不同场景中RNA空间组织的研究，包括mRNA疫苗、应激颗粒中的非编码RNA、腺相关病毒中的DNA等。