5-硝基吲哚衍生物的绿色、可扩展的超临界流体色谱分离技术：对映体特异性的生物学评估及COX-2抑制机制的探索

《European Journal of Medicinal Chemistry》：Green and Scalable Supercritical Fluid Chromatographic Resolution of 5-Nitroindoline Derivatives: Enantiomer-Specific Biological Evaluation and COX-2 Inhibition Insights

•开发了一种集成化的绿色工作流程，结合了Petasis多组分合成、手性超临界流体（SFC）分离和对5-硝基吲哚衍生物的生物评估。•使用装有固定化和涂层多糖手性固定相的填充柱SFC，实现了十种外消旋化合物的快速且可扩展的对映体分离。•建立了高通量的分析到制备SFC转化，基线分离时间在4-7分钟内，并有效分离出两种对映体。•通过UPLC-QTOF、LC-MS、1H NMR、FT-IR、CHNS、HPLC纯度和旋光分析进行了全面的立体化学和结构表征。•化合物4a和4b表现出对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌显著的抗菌和抗生物膜活性，显示出立体异构体依赖性的生物效应。•化合物4a(+)显示出选择性的COX-2结合能力和良好的热力学稳定性，这一点通过对接、分子力学/分子动力学（MM/GBSA）和FMO分析得到了证实，表明其是一种有前景的抗炎骨架。

引言
手性在小分子的生物行为中起着决定性作用，不同的对映体通常表现出明显的药理、代谢和毒性差异，这一概念自从沙利度胺悲剧凸显了立体化学差异对药物作用的影响后就已经得到广泛认可。因此，现代药物发现和开发非常重视获得对映体富集或纯的对映体，以及能够准确确定对映体过量并可靠分离单个对映体的分析平台[1]、[2]。在现代药物研究和开发中，生成单个对映体是一个关键要求，因为立体化学在决定药物候选物的生物活性、安全性和药代动力学行为方面起着重要作用[3]、[4]、[5]、[6]、[7]。在早期发现阶段，色谱分离已成为生产用于生物评估的对映体纯化合物的最有效和最具成本效益的方法之一。历史上，高效液相色谱（HPLC）被广泛用于手性分离，特别是在20世纪80年代开发出制备规模的方法后[8]、[9]、[10]、[11]。然而，近年来，超临界流体色谱（SFC）因其卓越的效率和操作优势，在制备对映体分离方面获得了广泛应用，尤其是在制药领域[8]、[10]、[12]、[13]。SFC使用超临界二氧化碳（CO2）作为流动相的主要成分，通常占系统的60%以上。当CO2的温度（31°C）和压力（73 atm）超过其临界值时，它处于超临界状态，表现出介于液体和气体之间的性质。这些物理化学特性，特别是低粘度和高扩散性，使得流速显著提高，从而实现更快的分离而不会显著损失色谱效率。SFC系统允许更高的线速度和更低的压降，从而加快了分析筛选速度，并提高了制备产率。因此，SFC有助于更快地分离出对映体，从而加速了药物发现过程。此外，该技术还提高了生产力，即单位时间内获得的纯化材料量，进一步增强了其在大规模制备应用中的适用性。
尽管具有这些优势，纯CO2对中等极性药物化合物的溶解能力有限。因此，SFC通常会加入有机修饰剂（如醇或其他极性溶剂）以获得足够的洗脱强度并优化分离性能。与制备HPLC相比，SFC通过用CO2替代大部分流动相显著减少了有机溶剂的消耗。分离后，CO2可以通过减压轻松去除，从而提高了产品浓度并减少了下游的溶剂去除和纯化时间。此外，SFC被认为是一种环境可持续的（“绿色”）分析和制备技术。减少有机溶剂的使用降低了运营成本，减少了废物产生，并提高了整体安全性，特别是与传统的非极性溶剂系统相比。总的来说，高效率、减少溶剂使用、提高生产力和环境优势相结合，使得SFC成为制药研究中手性分离的强大和首选工具。

由于CO2富集流动相的优良物理化学性质（包括低粘度、高扩散性和优越的质量传递特性），SFC已成为这些任务的首选技术。此外，使用固定化的多糖手性固定相提高了方法的稳健性，并实现了从分析筛选到制备规模纯化的无缝转化[14]、[15]。5-硝基吲哚是一种结构可适应的杂环基团，在医药和合成化学中越来越受到重视。作为一种功能化的吲哚骨架，它是合成药物、染料、精细化学品和农用化学品中间体的关键构建块[16]。许多研究强调了5-硝基吲哚衍生物的广泛生物相关性，这些衍生物具有多种活性，包括抗菌、抗真菌和抗结核作用[17]、[18]。据报道，这些化合物可以抑制多种病原体，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌、黑曲霉和结核分枝杆菌（WHO报告；抗菌研究）。除了抗菌应用外，硝基取代的吲哚衍生物还与抗肿瘤、抗炎、镇痛和心脏保护作用相关[19]。电子吸引性的硝基与吲哚核心的构象灵活性相结合，使这种骨架成为设计抗病毒剂、特种聚合物和现代农用化学品的理想结构。值得注意的是，吲哚衍生物的生物活性往往依赖于立体化学，不同的对映体在效力和靶点选择性上存在显著差异。尽管人们对基于硝基吲哚的治疗化合物越来越感兴趣，但系统研究其对手性分离和可扩展纯化的研究仍然有限。这一差距是将这些化合物转化为可行药物候选物的关键挑战，而获得纯对映体材料是必不可少的。鉴于5-硝基吲哚衍生物倾向于表现出立体化学依赖的生物结果，有效分离这些分子对于建立可靠的结构-活性关系和推进可行的药物候选物至关重要。先前的报告已经表明，基于硝基吲哚的化合物的对映体在抗菌效力和生化靶点选择性上可能存在显著差异，这强调了对手性选择性分离进行准确生物解释的必要性[1]。
除了已报告的抗菌特性外，基于吲哚的骨架还因其抗炎、酶抑制和靶点特异性的药理活性而在药物化学中引起了广泛关注。此外，α-芳基乙酸衍生物是一类重要的生物活性分子，经常出现在通过调节环氧化酶途径起作用的抗炎药物中。基于这些先例，我们假设将5-硝基吲哚核心与结构多样的芳基和杂芳基取代基结合可以生成具有抗菌和抗炎潜力的化合物。此外，由于立体化学可以显著影响靶点识别和生物活性，获得单个对映体对于建立有意义的结构-活性关系和评估立体化学依赖的生物反应至关重要。从药物化学的角度来看，选择5-硝基吲哚骨架作为核心结构是因为硝基吲哚衍生物与广泛的生物活性相关，包括抗菌和抗炎作用。此外，α-芳基乙酸基团引入了生物活性分子中常见的结构特征，并提供了一个适合研究立体化学依赖性活性的手性中心。为了探索结构-活性关系，通过Petasis多组分反应引入了一系列芳基和杂芳基硼酸。所选取代基旨在提供芳香表面积、亲脂性、电子性质、空间效应和氢键能力的系统变化。这种策略生成了一个结构多样的5-硝基吲哚衍生物库，以评估分子结构和立体化学对抗菌和COX-2抑制活性的影响。

在这项研究中，我们通过Petasis多组分反应合成了一系列手性的5-硝基吲哚衍生物α-芳基乙酸（方案1，表1），并开发了一种系统的SFC方法来进行对映体分离。主要目标是建立一个绿色、可扩展且广泛适用的色谱平台，能够生产适用于生物评估的对映体富集分子。手性分离后，分离出的立体异构体被评估了其抗菌、抗生物膜和COX-2抑制活性，以考察立体化学对生物性能的影响。因此，本研究将合成化学、制备手性SFC和生物评估整合到一个统一的工作流程中，用于发现和评估具有立体化学定义的生物活性分子[20]、[21]。

在多种基于多糖的手性固定相上进行了全面的分析筛选，随后将优化的分析条件转化为制备规模纯化，几乎不需要重新优化，从而能够进行下游的生物评估。为了确保透明度和可重复性，支持信息中提供了完整的光谱和色谱数据集，符合当代最佳分析报告实践[22]。

**化学试剂和材料**
超临界流体色谱（SFC）级二氧化碳（CO2）从Bhuruka Gases Ltd.（印度班加罗尔）购买。HPLC级溶剂，包括异丙醇（IPA）、甲醇、乙醇和乙腈，从Aceto Pharma（印度艾哈迈达巴德）购买。流动相添加剂如异丙胺（IPAm）、三乙胺（TEA）、二乙胺（DEA）、甲醇胺（25%）、 trifluoroacetic acid（TFA）和甲酸（FA），以及二氯甲烷（DCM），也是从Chiral Resolution and Optical Rotation Analysis购买的。

**化合物4a-4j的对映体分离**
化合物4a-4j（表1）的对映体分离通过分析和制备手性SFC方法成功实现，获得了高对映体过量值（ee）从90.54%到100%。分析和纯化样品的保留时间非常一致，证实了分离协议的可重复性和可靠性。化合物4a、4b、4e、4f、4g和4j表现出基线分离，至少有一种对映体...

**结论**
本研究的主要目标是开发一种可扩展和绿色的SFC方法，用于5-硝基吲哚衍生物的对映体分离，同时结合生物学研究来展示立体化学在决定生物活性中的重要性。通过Petasis多组分反应成功合成了一系列新型5-硝基吲哚衍生物α-芳基乙酸衍生物，并对其进行了系统的对映体分离。

**作者贡献声明**
Prashantha Kalappa：写作 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、可视化、资源、形式分析、数据管理
NANDEESH K N：写作 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、可视化、验证、监督、资源
Upputuri Harikrishna：写作 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、方法学、研究、数据管理
Vivek Hamse Kameshwar：写作 - 审稿与编辑、验证、软件、形式分析、数据管理
Govinakere Mallegowda

**利益冲突声明**
作者声明他们没有任何已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**资金**
本研究未收到公共、商业或非营利部门的任何特定资助。

**致谢**
我们非常感谢M/s. Syngene International（印度班加罗尔）发现化学-分析研究部门（DC-ARD）主任对这项研究的支持。

**作者名单**
Upputuri Harikrishna | Vivek Hamse Kameshwar | Govinakere Mallegowda | Dhanush | Prashantha Kalappa | Nandeesh Kebbahalli Nagalingaiah