基于离子迁移-质谱的人乳寡糖高通量定量：从多重标准添加至单点校准

《Food Chemistry》：High-throughput quantification of multiple human milk oligosaccharides by ion mobility-mass spectrometry: From standard addition to single-point calibration

　　

人乳寡糖（HMOs）是母乳中的生物活性聚糖，通过塑造菌群、抵御病原体和调节免疫系统对婴儿健康产生贡献。因此，定量母乳中的HMOs对于关联乳汁组成与生物学及健康结局至关重要。重要的是，HMO组成在母亲间存在显著差异，无论是绝对浓度还是异构体比例，这在很大程度上由母体特征驱动，尤其是母亲的分泌者状态。然而，捕捉这种变异性在分析上具有挑战性，因为母乳中的基质组成会影响分析物响应，可能导致信号抑制或增强以及有偏的定量结果。此外，HMO定量还受到广泛的结构多样性和异构现象以及宽浓度范围的限制。高纯度HMO标准品的高成本和有限供应仍然是HMO定量的实际制约因素。因此，可靠的基质补偿定量对于实现有意义的样本间比较至关重要。

高效阴离子交换色谱（HPAEC）与脉冲安培检测器（PAD）联用是定量已知寡糖的常用技术。然而，其有限的结构分辨率限制了对异构HMOs的区分能力，从而限制了其在异构体分辨表征与定量中的应用。相比之下，液相色谱-质谱（LC-MS）方法，通常采用多孔石墨化碳（PGC）柱与质谱/质谱（MS/MS）实验联用，已证明在解析和定量大量HMOs方面具有较强能力。虽然LC-MS/MS工作流程可以解析大量HMO异构体，但分析通量常因分析时间长和样品制备复杂而受到限制，限制了其在人群规模研究中的应用。

因此，人们越来越关注提高分析通量而不牺牲异构体分辨率的分析策略。离子迁移-质谱（IM-MS）为快速异构体表征提供了补充途径。此外，高分辨离子迁移平台的技术进步，包括捕集离子迁移谱（TIMS）和无损离子操纵结构（SLIM），显著增强了对密切相关HMO异构体的分离。通过基于衍生化的策略，TIMS-MS可实现异构体特异的HMO定量。最近，TIMS-Tof仪器上靶向单离子迁移监测（SIM2）采集技术的开发，实现了母乳中HMO异构体的快速、无衍生化直接分析。通过将单个采集中的若干相邻SIM2窗口组合，SIM2拼接方法在保持高迁移分辨率和灵敏度的同时扩展了离子迁移覆盖范围。在最近的研究中，研究人员应用这种高分辨离子迁移策略同时测定六种HMO对的异构体比例，为高通量异构体分辨组成分析奠定了基础。

对于HMOs这类内源性分析物，从相对分析谱走向准确定量需要稳健的校准策略，以在缺乏真正无分析物空白乳汁基质的情况下考虑基质效应。之前，基于靶向SIM2采集的标准添加法已应用于乳汁样品中单个HMO（即2^′-FL）的定量。下一步是将基质补偿定量扩展到母乳中多种HMOs的多重分析，同时通过SIM2拼接方法保持分析通量。标准添加校准（SAC）尤其与人乳中HMOs的绝对定量相关，其中内源浓度通过外推由同一样品等分试样加入递增标准品量所构建的校准曲线来估计。在本研究中，研究人员开发了一种多重标准添加策略，用于同时定量母乳中的九种HMOs（即2^′-FL、3-FL、3^′-SL、6^′-SL、LDFT、LNFP-I、LNFP-V、LNDFH-I和LNDFH-II）。所靶向的HMOs经过选择，包括母乳中丰富的HMOs、与分泌者和Lewis血型相关的岩藻糖基化化合物等生物学信息性物质，以及挑战分析区分的异构物种。研究人员以两种HMO组成存在显著差异的母乳样品，在不同稀释因子下进行了研究，以表征基质依赖响应并评估所提出校准策略的可行性。

此外，除了普通最小二乘（OLS）回归，还评估了加权最小二乘（WLS）拟合方法在校准曲线构建中的应用。尽管加权线性回归常用于异方差性数据（即测量误差的方差在浓度范围内变化），但其对标准添加定量的实际增益仍有待使用与校准精度及外推内源浓度估计相关的标准进行评估。同时，研究了单点标准添加校准作为一种最简单的校准方法，以评估单一加标水平是否能够提供足够准确的浓度估计。

人乳寡糖（HMOs）是母乳中关键的生物活性成分，在塑造婴儿肠道菌群、抵御病原入侵及调节免疫应答等方面发挥重要作用。由于HMO组成在母亲间存在显著个体差异，且受母体特征（尤其是分泌者状态）影响，建立可靠的定量方法对于关联乳汁组成与婴儿健康结局至关重要。然而，HMO定量分析面临多重挑战：母乳复杂基质易产生信号抑制或增强效应；HMO结构具有高度多样性与异构性，浓度跨度大；高纯度标准品稀缺且昂贵。传统的高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测器（HPAEC-PAD）技术因结构分辨率有限，难以有效区分异构体；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）虽具备较强的异构体分辨能力，但分析耗时较长、样品前处理繁琐，难以胜任大规模人群研究。近年来，离子迁移-质谱（IM-MS）技术，特别是高分辨平台如捕集离子迁移谱（TIMS）和无损离子操纵结构（SLIM），为快速HMO异构体分析提供了新途径。针对HMOs内源性特征，在缺乏真正无分析物空白基质的前提下，标准添加法成为消除基质干扰、实现绝对定量的有效策略。既往研究已基于靶向单离子迁移监测（SIM2）采集技术实现了单个HMO（2^′-FL）的定量，本研究旨在将该策略拓展为多重分析模式，并同步评估不同校准策略在复杂母乳基质中的适用性。该论文发表于《Food Chemistry》。

在开展研究过程中，研究人员以两名健康哺乳期母亲的母乳样本（BM-A采自早期泌乳期，BM-B采自成熟期泌乳期）为研究对象，系统建立了基于流动注射-单离子迁移监测拼接（FIA-SIM2-stitching）技术的多重HMO定量方法。研究采用甲醇/水体系对母乳进行去脂稀释处理，通过TIMS-Tof平台结合正离子电喷雾电离（ESI）模式，以钠加合物离子（[M+Na]⁺）形式检测目标HMOs。在方法开发阶段，研究人员通过宽稀释范围筛选（500至20 000倍）优化了样品稀释因子，最终选定5 000倍稀释作为平衡基质效应与信号强度的最佳条件。定量策略方面，研究比较了普通最小二乘（OLS）与加权最小二乘（WLS）回归在标准添加校准（SAC）中的性能，并探索了单点标准添加校准（SPC）作为简化方案的可行性。通过上述工作，研究人员旨在建立一种无需复杂色谱分离、可在数分钟内完成多种HMO异构体分辨且能补偿基质效应的高通量定量方法。

**3.1 FIA-SIM2-stitching MS方法用于多种HMO异构体分析**

研究结果表明，FIA-SIM2-stitching方法能够在3分钟内完成9种HMOs（包括2^′-FL、3-FL、3^′-SL、6^′-SL、LDFT、LNFP-I、LNFP-V、LNDFH-I和LNDFH-II）的分离检测，但不同分析物响应强度差异显著。宽稀释范围实验显示，在500至2 000倍低稀释条件下，部分HMOs（如3-FL和LNDFH-II）出现平台效应，表明强基质信号抑制；当稀释倍数超过2 000倍后，信号响应与稀释因子呈线性关系，而20 000倍稀释时灵敏度下降。据此，5 000倍稀释被确定为后续定量的最佳工作条件。

**3.2 HMO的标准添加定量**

在HMO的标准添加定量方面，研究人员对BM-A样本在5 000倍稀释下进行六水平（0至0.6 ng/μL）标准添加分析，所有目标HMO均呈现良好线性（R²≥0.97）。然而，OLS回归假设的方差齐性在实际数据中被打破，响应标准差随加标浓度升高而增大，呈现典型异方差特征。WLS回归通过逆方差加权有效校正了该效应，在降低校准范围变异系数（CV_range）方面表现更优，尤其对2^′-FL、LDFT、LNFP-I和LNFP-V等低丰度内源信号的估计改善明显。留一法交叉验证表明，两种模型预测精度相近（多数HMO平均绝对相对误差低于12%），但WLS为LDFT等信号提供了更具物理意义的外推浓度，而OLS曾导致负值结果。跨样本分析显示，BM-A（非分泌者型）与BM-B（分泌者样）中部分HMOs（3-FL、3^′-SL、6^′-SL、LNFP-I和LNDFH-I）的回归斜率比接近1，提示这些化合物基质效应具有跨样本可比性；但2^′-FL、LDFT、LNFP-V和LNDFH-II的斜率差异显著，表明基质补偿策略仍需保持分析物特异性。

**3.3 单点标准添加校准（SPC）的适用性**

在单点标准添加校准（SPC）适用性方面，研究评估了0.1至0.6 ng/μL共五个加标水平。结果显示，0.1 ng/μL因未引起足够的响应变化，在BM-A中导致2^′-FL和3-FL等出现超过50%的偏差，不适用。而0.2至0.6 ng/μL范围内的SPC估计值与多点SAC参考值具有较好一致性。值得注意的是，内源浓度较低的2^′-FL在BM-A中表现出系统性正偏倚，提示对于低丰度分析物需避免过低加标水平。SPC策略在加标水平选择适当时，可有效复现多点SAC的定量结果，显著减少样品制备与检测工作量。

讨论部分指出，由于不存在真正的无HMO空白母乳基质，标准添加法是克服基质效应、实现绝对定量的必要手段。WLS回归在处理生物基质常见的异方差数据时，较OLS能提供更稳健的内源浓度外推估计。5 000倍稀释在多数HMO中实现了降低基质抑制与维持足够灵敏度之间的平衡。虽然部分HMO在不同样本间呈现相似校准行为，提示基质匹配外标法的潜在可能，但这种一致性具有分析物依赖性，样本特异性校准仍具重要价值。

研究结论表明，多重FIA-SIM2-stitching-MS条件下的标准添加法为母乳中HMOs内源浓度测定提供了有效的基质补偿框架。OLS与WLS回归性能总体相当，但WLS更好地解释了响应方差的异方差性，通常降低了其对外推浓度（C₀）估计的影响，因此被用于最终浓度估计。选择适当稀释因子对准确量化至关重要，5 000倍稀释为缓解基质效应提供了实用的折中条件。两种母乳样本在部分特定HMO上表现出相似的校准行为，但该趋势无法系统推广至所有化合物。最后，SPC在适当加标水平下能够成功复现多点SAC获得的内源浓度估计，显示出作为一种简化快速方法的潜力。未来需在更大规模、更多样化的母乳样本中进一步验证其性能，以支持高通量HMO定量。