大气冷等离子体对小球藻（Chlorella vulgaris）蛋白分离物消化性、结构完整性、功能特性与安全性的影响

《Innovative Food Science & Emerging Technologies》：Impact of atmospheric cold plasma on digestibility, structural integrity, functional properties, and safety of protein isolate from Chlorella vulgaris

　　

微藻是新兴、营养丰富且可持续的蛋白质来源，可满足全球不断增长的需求。然而，其食品应用受到若干因素阻碍，如功能特性较差以及存在过敏原和抗营养因子等。本研究采用不同输入电压（140、160和200 V）产生的大气冷等离子体（atmospheric cold plasma, ACP）处理从Chlorella vulgaris分离的蛋白质5、10和20 min，并评价其对结构变化、蛋白质消化性、致敏性和功能特性的影响。适度ACP处理（140 V-20 min和160 V-5 min）为最佳条件，因其提高必需氨基酸（essential amino acids, EAAs）含量并获得最高蛋白质消化性水平（0.99–1）。然而，提高处理强度可导致蛋白质降解并降低其消化性。200 V-5 min处理使蛋白质结构展开并修饰氨基酸侧链，使蛋白质表面疏水性（surface hydrophobicity, H₀）从215增至228 a.u.。此外，适当ACP处理使蛋白质持水性（water holding capacity, WHC）提高11%、乳化活性（emulsifying activity）提高27%、起泡膨胀性（foaming expansion）提高12%，降低其抗营养因子，包括胰蛋白酶抑制剂、单宁和植酸，分别降低57%、36%和66%，并将其预测致敏潜力降低51%。这些发现证明ACP是促进食品和营养保健品行业开发新型、安全且营养配料的有效技术。

研究背景方面，全球对可持续且营养丰富蛋白质来源的需求不断增加，微藻因生长快、占地少、可固碳且蛋白含量较高而受到食品行业关注。然而，微藻蛋白从实验室结果转化为食品制造仍受抗营养因子（如植酸、单宁、胰蛋白酶抑制剂）、功能特性较差（如持水、乳化、起泡能力）以及消化后致敏性/毒性等问题阻碍，因此需要对微藻蛋白进行适当改性。ACP是一种由活性氧氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）、电子、自由基和紫外光子等组成的非热技术，可修饰蛋白质而不产生热处理的负面影响，但原文指出ACP对微藻蛋白的影响尚未被探索。基于此，研究人员以被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）认定为一般公认安全（Generally Recognized as Safe, GRAS）的Chlorella vulgaris为对象，系统评价ACP电压和暴露时间对蛋白分离物消化性、结构完整性、功能特性、抗营养因子及肽致敏性和毒性的影响，以期为食品和制药应用提供更安全、更易消化且功能多样的微藻蛋白配料。

关键技术方法方面，研究人员以商业C. vulgaris粉（XPRS Nutra，Las Vegas，NV，USA）经碱溶酸沉分离蛋白（回收率16%）；采用针-板ACP以空气为工作气，频率1000 Hz、占空比56 μs，140/160/200 V处理5/10/20 min；测定消化性与PDCAAS、氨基酸组成、FTIR、UV-Vis、浊度、ANS表面疏水性及WHC、OBC、EAI、ESI、FE、FS；检测胰蛋白酶抑制剂、总单宁和植酸；对优选样品行INFOGEST静态体外消化，nanoLC-Orbitrap MS表征肽，并行in silico致敏与毒性预测及多变量统计。

研究结果如下。3.1 大气冷等离子体对微藻蛋白特性的影响：研究人员通过上述结构、消化和功能分析发现，ACP效果与电压和处理时间有关。3.1.1 氨基酸组成：通过酸水解-HPLC分析发现，ACP对必需、非必需、疏水性、亲水性和带电荷氨基酸影响多为轻微且无明确趋势；140 V-20 min处理获得最高EAAs（42.4%），条件必需氨基酸（conditionally essential amino acids, CEAAs）由20.0%升至20.2–23.0%，高强度处理则降低EAAs和NEAAs。3.1.2 蛋白质消化性：通过Megazyme蛋白消化性试剂盒测定发现，对照体外消化性为0.98，温和处理可升至0.99–1，所有组PDCAAS均为1；160 V-20 min和200 V-5 min消化性为0.99，低于其他样品；多数样品限制氨基酸为组氨酸，140 V-5 min和200 V-10 min为苏氨酸。3.1.3 二级结构：通过FTIR分析发现，ACP处理样品酰胺I带和酰胺II带峰强度一般低于对照，提示肽键断裂；二级结构以β-折叠（β-sheet）为主，CH₃和CH₂相关峰降低，与含甲基侧链氨基酸含量由36%降至约33%一致。3.1.4 三级结构：通过UV-Vis分析发现，低于400 nm区域吸光度随电压或时间增加总体升高，280 nm吸光度由140 V-5 min的2.32降至200 V-20 min的1.91；高波长区域吸光度随处理时间增加而降低，提示蛋白片段化或芳香性丧失。3.1.5 浊度：通过600 nm吸光度测定发现，ACP一般使浊度由0.407升至0.436–0.447，低强度处理不足以引起显著结构变化，160 V-20 min最高（0.447），表明蛋白聚集增强，并与该条件及200 V-5 min消化性较低一致。3.1.6 表面疏水性：通过ANS荧光探针法发现，对照H₀为214.6 a.u.，140 V-5 min降至212.1 a.u.；140和160 V延长处理分别升至215.3和225.8 a.u.，160 V样品均高于140 V；200 V-5 min最高（227.9 a.u.），但随处理时间延长明显下降。3.1.7 功能特性：通过WHC、OBC、EAI、ESI、FE和FS测定发现，对照WHC为382%、OBC为197%，140 V处理使WHC随处理时间升至422%，OBC降至176%–191%；EAI由98 m²/g最高升至125 m²/g，ESI由29 min升至37–42 min；FE由162%最高升至182%，FS在60 min由102%最高升至160 V-20 min的138%，200 V延长处理使FS下降。3.2 抗营养因子：通过TIA、总单宁（total tannins, TTC）和植酸测定发现，除140 V-5 min外，ACP显著降低这些抗营养因子36%–66%；TIA由0.28 TIU/mg降至140 V-20 min的0.19 TIU/mg和200 V-20 min的0.17 TIU/mg，TTC由0.30 mg ChE/g降至0.19 mg ChE/g，植酸由约0.12降至200 V-20 min的0.04。3.3 多变量分析：3.3.1 处理参数及其交互作用中，一般线性模型显示电压、时间及其交互作用对氨基酸组成、抗营养因子、PDCAAS、功能特性、H₀和浊度等多有显著影响；3.3.2 相关性分析显示疏水性氨基酸与电压正相关，CEAAs和带电荷氨基酸与时间负相关，TIA与电压和时间正相关，TTC和植酸与TIA正相关，TIA与PDCAAS负相关，体外消化性与PDCAAS正相关；3.3.3 主成分分析中PC1解释33.7%、PC2解释62.4%的数据变异，PC1主要将抗营养因子与其他特性分开，PC2将电压与结构、组成和功能特性聚类，并将时间与消化性、PDCAAS、WHC和FS₁₂₀等聚类。3.4 INFOGEST后肽表征：研究人员选择140 V-20 min样品行INFOGEST静态体外消化并用nanoLC-Orbitrap MS及in silico预测发现，对照肽均无毒但超过81%预测为致敏原，ACP处理样品肽谱改变，预测致敏性降低超过51%，毒性均为阴性，但包括DTAGLSADPETFARY等部分肽仍预测为致敏原。3.5 放大、安全与法规挑战：原文指出放大需研究反应器几何、样品-电极距离、RONS分布与扩散、单位样品质量能量输入和工作气连续流等；RONS可能形成亚硝酸盐/硝酸盐、臭氧和过氧化氢等副产物，需进行安全评估；ACP食品法规依应用、等离子体配置、加工条件、食品基质和安全性证据及各国立法而异，美国全谷物介质阻挡放电等离子体处理已由USDA-FGIS、EPA和FDA检查，欧洲委员会食品安全机构也发布了用于食品处理新兴技术监管审批的官方简报文件。

讨论部分总结认为，适度ACP处理可改善微藻蛋白氨基酸水平、消化性和功能特性，并降低抗营养因子和预测致敏性；但过高处理强度可引起蛋白质降解、聚集和消化性下降，且功能特性变化依赖电压和时间。原文同时强调放大工艺、副产物安全和法规审批需进一步研究，in silico致敏性与毒性结果仍需免疫学实验验证。研究结论部分翻译如下：从C. vulgaris生物质分离的蛋白质经不同条件ACP处理，并对其消化性、结构、功能和安全进行了全面分析。轻度或中度ACP处理（140–160 V和5–10 min）有利于提高蛋白分离物氨基酸水平，主要为EAAs、CEAAs和亲水性氨基酸（HIAAs）；但高强度处理（200 V和20 min）显示降解作用，尤其对EAAs和NEAAs。ACP处理还改善蛋白分离物消化性而不损害其PDCAAS。ACP改变蛋白分离物二级和三级结构及聚集行为，160 V-20 min为最强处理。此外，ACP处理显著改变蛋白分离物功能特性，但效果主要取决于所采用电压和处理时间。200 V-20 min ACP处理后，蛋白分离物抗营养因子（胰蛋白酶抑制剂活性、总单宁和植酸）显著降低36%–66%。ACP处理蛋白分离物衍生肽谱不同，含更多生物活性肽，in silico预测致敏性降低51%。尽管生物信息学预测工具显示ACP联合酶消化可成为生产非致敏和非毒性微藻肽的有前景方法，仍需细胞实验（如肥大细胞脱颗粒和嗜碱性粒细胞活化试验）、动物模型或患者血清免疫球蛋白E结合试验的免疫学证据进一步研究。