一种新型的木栖苏琪山菌素β-δ-木聚糖酶，在Phaffii梳状芽孢杆菌中表达

《International Journal of Biological Macromolecules》：A novel Sugiyamaella lignohabitans β- d-xylosidase expressed in Komagataella phaffii

　　•新型GH3家族β-d-木糖苷酶的异源表达
•通过HCDC工艺提高重组酵母β-d-木糖苷酶的产量
•β-d-木糖苷酶表现出非常低且独特的最佳pH值3.5
•GH3 β-d-木糖苷酶对阿拉伯糖基化木寡糖的新活性

引言
当前可再生能源领域的一个挑战是将大量产生的木质纤维素生物质进行生物转化。这些生物质来源于各种工业的废弃物，包括硬木、软木、农业残余物和草类，具有作为可再生能源的巨大潜力，尤其是作为生产第二代生物燃料或高附加值产品的原料[1]，[2]。植物生物质主要由多糖（纤维素、半纤维素和果胶）和木质素组成[1]，[3]。在半纤维素多糖中，木聚糖作为一种可发酵糖源特别值得关注[1]，[4]，[5]。植物木聚糖由通过β-1,4-糖苷键连接的d-木酮糖残基构成主链，该链可能被(4-O-甲基)-d-葡萄糖醛酸、乙酰基或阿拉伯糖等取代基修饰，并进一步通过阿魏酸或对香豆酸酯化。不同植物物种中的取代基类型各不相同[2]，[6]，[7]。由于植物木聚糖化学结构复杂且具有异质性，其完全水解为单糖成分需要多种木聚糖降解酶（称为木聚糖酶）的协同作用。这些酶包括内切-1,4-β-木聚糖酶（EC 3.2.1.8）、β-d-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）、α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（EC 3.2.1.55）、α-d-葡萄糖醛酸酶（EC 3.2.1.131）、乙酰木聚糖酯酶（EC 3.1.1.72）以及阿魏酸或对香豆酸酯酶（EC 3.1.1.73）[4]，[8]，[9]。β-d-木糖苷酶在木聚糖裂解中起关键作用，因为它们能水解木聚糖主链中的最多糖苷键[4]，[10]。这些酶通常与内切-β-1,4-木聚糖酶结合使用，将木聚糖降解为较小的木寡糖或木二糖。随后β-d-木糖苷酶通过从非还原端切割木糖单元来进一步水解这些中间产物[4]，[11]，[12]。高浓度的单糖（尤其是木糖、阿拉伯糖和葡萄糖醛酸）可能会抑制β-d-木糖苷酶的活性，因为这些单糖是木聚糖降解的终产物[13]。细菌、丝状真菌、酵母和某些高等真核生物通常会产生这些酶。它们的最佳活性条件一般在40–70?°C的温度范围内和3.0–6.5的pH值之间，某些来自极端嗜热细菌的β-d-木糖苷酶除外[4]，[9]，[12]，[13]，[14]。根据Carbohydrate-Active Enzymes数据库（CAZy；https://www.cazy.org/；[15]）的分类，β-d-木糖苷酶被归入八个糖苷水解酶（GH3、GH30、GH39、GH43、GH52、GH54、GH116和GH120）家族，反映了它们不同的结构和催化特性。这些酶通常具有保实性催化机制；然而，GH43家族成员则表现出反转机制[16]，[17]。鉴于由内切-β-1,4-木聚糖酶产生的4-O-甲基-d-葡萄糖醛酸（MeGlcA）和/或阿拉伯糖基化木寡糖的复杂结构，了解个别β-d-木糖苷酶如何与这些修饰的底物相互作用对于酶工程和工业应用至关重要[18]。尽管β-d-木糖苷酶普遍存在，但它们对修饰木寡糖的活性尚未得到完全研究。β-d-木糖苷酶切割的非还原端Xylp残基不能被进一步修饰，但某些β-d-木糖苷酶可以容忍相邻的Xylp残基发生取代。研究表明，来自Trichoderma reesei的GH3 β-木糖苷酶TrXyl3A和来自Bacillus halodurans C-125的GH39 BhXyl39在相邻Xylp残基被4-O-甲基-d-葡萄糖醛酸取代时仍能释放非还原端Xylp残基[19]，[20]。同样，T. reesei的GH3 β-木糖苷酶TrXyl3A、Clostridium stercorarium的Bxl3B、Segatella baroniae的Xyl3C、B. halodurans C-125的GH39 BhXyl39和C. stercorarium的GH43 Arf43A也能容忍相邻Xylp残基被l-阿拉伯呋喃糖基取代[19]，[20]，[21]，[22]。只有后两种酶在相邻Xylp残基被O-3-阿拉伯糖基化时仍能释放Xylp残基。看来，位置3的修饰对β-d-木糖苷酶的活性影响更大。没有GH3 β-木糖苷酶被证明对O-3-阿拉伯糖基化木寡糖具有活性。一些β-d-木糖苷酶，如S. baroniae的Xyl3B和B. halodurans C-125的BhXyl52，不能容忍倒数第二个Xylp残基的任何修饰，仅对线性木寡糖（XOS）具有活性[19]，[21]。

在本文中，使用了Komagataella phaffii酵母表达宿主，从未被探索的Sugiyamaella lignohabitans中生产重组β-d-木糖苷酶。这种表达宿主支持高细胞密度培养（HCDC）并便于对外分泌重组蛋白进行翻译后修饰[23]，[24]，[25]。Sugiyamaella属属于Trichomonascaceae家族，其中一些物种（如S. boreocaroliniensis、S. novakii、S. xylanicola和S. lignohabitans）与木材腐烂过程相关。该属的生物技术价值在于其能够利用d-木糖生产乙醇和/或木糖醇，以及其在木质纤维素生物质转化中的木聚糖降解活性[26]。在研究GH30木聚糖酶的过程中，发现S. lignohabitans产生了一种名为SlXyn30A的GH30酶，该酶已被克隆、表达并鉴定为葡萄糖醛酸木聚糖酶/木二糖水解酶[27]。通过CAZy数据库分析，发现S. lignohabitans中存在多个属于GH3、GH5、GH10、GH115和15CE家族的潜在木聚糖酶。在归类为GH3家族的5种蛋白质中，有一种蛋白质（GenBank: ANB12660.1，Uniprot: A0A167D9X3）与T. reesei的β-d-木糖苷酶TrXyl3A（Uniprot: Q92458）和Aspergillus nidulans的XlnD（Uniprot: Q5BAS1）的相似度分别为54.1%和53.4%，表明其具有β-d-木糖苷酶功能。编码该蛋白质的基因被克隆并在K. phaffii中表达。成功表达和鉴定出具有催化活性的新型酵母β-d-木糖苷酶，扩展了我们对酵母半纤维素降解酶系统的理解，并揭示了其在生物质转化中的潜在生物技术应用。

部分内容
**微生物与培养基**
本实验使用的是经过pPICZα-A质粒转化的Komagataella phaffii KM71H（MutS）（Invitrogen，美国），该质粒包含来自S. lignohabitans的β-d-木糖苷酶基因（GenBank ANB12660.1，UniProt A0A167D9X3）。目标基因由Generay Biotech Co. Ltd.（上海，中国）合成并克隆到K. phaffii表达载体pPICZα-A（EcoRI和NotI限制性内切酶切位点）中，插入片段与酿酒酵母α因子分泌信号序列连续排列。

**结果与讨论**
许多研究描述了β-d-木糖苷酶、其重组表达、生化特性或结构。然而，这些木聚糖酶大多来源于细菌或真菌，例如来自Bacillus sp.、Geobacillus sp.、Aspergillus sp.、Penicillium sp.和Talaromyces amestolkiae的β-d-木糖苷酶[14]，[36]。因此，像S. lignohabitans这样的酵母中存在β-d-木糖苷酶为研究这些酶的新特性提供了独特的机会。

**结论**
总之，利用K. phaffii表达系统在3-L生物反应器中成功生产出了来自S. lignohabitans的重组GH3 β-木糖苷酶SlXyl3A，并通过一步阴离子交换层析法纯化了该酶。该酶的最佳pH值为3.5，最佳温度为50?°C，在储存过程中表现出较高的热稳定性，显示出其在工业应用中的巨大潜力。这是一种外切型β-d-木糖苷酶，能够高效释放...

**作者贡献声明**
Pavol Dobrovodsky：撰写-初稿、可视化、验证、数据分析。
Walid Fathalllah：撰写-初稿、可视化、验证、数据分析。
Ivona Haluzová：验证、数据分析。
Zuzana Mar?eková：撰写-初稿、验证、数据分析。
Vladimír Puchart：撰写-审阅与编辑、可视化、数据分析。
Katarína ?uchová：撰写-审阅与编辑、可视化、验证。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。

**致谢**
本工作得到了斯洛伐克研究与发展机构（Contract No. APVV-22-0207）的支持。

**作者列表**
Pavol Dobrovodsky | Walid Fathalllah | Ivona Haluzová | Zuzana Mar?eková | Vladimír Puchart | Katarína ?uchová | Martin Rebro?