开发用于检测针对伪狂犬病病毒的中和抗体的阻断ELISA方法

《International Journal of Biological Macromolecules》：Development of blocking ELISA for detection neutralizing antibodies against pseudorabies virus

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摘要

伪狂犬病由伪狂犬病病毒（PRV）引起，其特征是猪出现发热、繁殖障碍和神经系统症状。PRV的病毒糖蛋白D（gD）在介导宿主细胞进入和诱导中和抗体产生方面起着关键作用。本研究成功建立了一种能够稳定分泌和表达gD-Fc融合蛋白的A BHK细胞系，并将其适应于悬浮培养。上清液中的目标蛋白被纯化后用于后续的小鼠免疫实验。通过间接酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光试验（IFA）成功生成并鉴定出两种单克隆抗体（mAbs），即1B5和1H6，它们特异性识别PRV gD蛋白的两个构象依赖性表位。功能表征显示，这两种mAb均具有中和活性，IC₅₀值分别为38.01 μg/mL和4.86 μg/mL，并且其结合可以被PRV阳性血清有效阻断。此外，这两种mAb识别的两个表位在包括HLJ8、HeN1、SC和Bartha株在内的常见PRV分离株中具有高度保守性。基于这些特性，建立了一种阻断ELISA（bELISA）方法来检测PRV中和抗体的水平。该方法的特异性和敏感性可与病毒中和试验（VNT）相媲美，能够检测稀释至1:512的PRV阳性血清。对115份临床猪血清样本的测试显示，bELISA和VNT之间的符合率高达93.9%。总体而言，这种bELISA为评估PRV疫苗诱导的免疫提供了可靠且实用的工具。

引言

伪狂犬病，又称奥杰斯基病（Aujeszky's disease），仍然是影响全球养猪业最具经济影响的传染病之一[1]。其病原体伪狂犬病病毒（PRV）是一种有包膜的雙链DNA病毒，属于水痘病毒属（Varicellovirus）、α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）和疱疹病毒科（Herpesviridae）[2], [3]。PRV具有广泛的宿主范围，可感染多种哺乳动物物种，包括人类，但猪是其自然宿主和病毒库[4], [5], [6], [7], [8]。感染通常表现为严重的神经系统症状、呼吸窘迫和仔猪的高死亡率，而怀孕的母猪常出现流产、死产或胎儿木乃伊化[9]。尽管Bartha-K61疫苗在中国有效控制了伪狂犬病数十年，但自2011年以来出现的变异株导致了疫情的反复爆发。值得注意的是，Bartha-K61疫苗对这些变异株的保护作用不完全，尤其是在新生仔猪中，导致全国范围内PRV感染的再次出现[10], [11]。在这种情况下，准确评估中和抗体水平对于评估疫苗的保护效果、监测群体免疫状态和指导接种策略具有重要意义。

在现有的检测方法中，病毒中和试验（VNT）因其能直接测量具有功能活性的中和抗体而被广泛认为是量化PRV中和抗体和评估疫苗诱导保护免疫力的金标准。然而，其在大规模监测或常规检测中的应用受到技术要求高、检测通量低和周转时间长的限制[12]。相比之下，血清学检测是评估猪体内抗体水平的常用方法。目前有商业试剂盒专门针对PRV的糖蛋白B（gB）和gE。基于gB的酶联免疫吸附试验（ELISAs）用于监测gB特异性抗体（这些抗体出现相对较早），并提供了群体血清状态的概览，而基于gE的ELISAs主要用于区分自然感染和接种疫苗的动物[13], [14], [15]。需要注意的是，现有的gB或gE ELISA试剂盒旨在检测结合抗体，这些抗体反映了暴露或免疫原性，但不能反映功能性的免疫保护。因此，仍需要一种稳健、高通量的血清学检测方法来估计PRV中和活性，从而实现更全面和操作上可行的疫苗效果评估。

gD是PRV的关键包膜糖蛋白，在介导病毒进入宿主细胞方面起着不可或缺的作用[16], [17]。具体而言，gD促进了病毒包膜糖蛋白与宿主细胞表面受体（包括nectin-1、nectin-2、3-O-硫酸化肝素（3-O-S-HS）和thrombospondin-3（THBS3）[18], [19], [20]）之间的相互作用。作为在自然感染和接种疫苗过程中诱导PRV特异性中和抗体的主要免疫原，gD始终能引发强烈的体液免疫反应。抗gD抗体已被严格证明具有显著的中和活性，并在体内和体外提供重要的保护作用[21]。因此，gD特异性抗体滴度是评估PRV中和活性的可靠且功能相关的标志物。

本研究构建了一种表达重组gD-Fc蛋白的稳定BHK细胞系，以促进真核细胞中正确折叠的gD的产生。纯化的重组蛋白用于小鼠免疫，成功生成并鉴定出一组针对gD的单克隆抗体（mAbs）。这些mAb表现出强的病毒中和活性，并可被PRV阳性血清有效阻断，证明了它们适用于血清学检测的开发。基于mAb 1B5和1H6，我们建立了一种阻断ELISA（bELISA），并进一步评估了gD特异性抗体水平与病毒中和滴度之间的相关性。这些发现支持了gD bELISA作为评估PRV中和抗体反应的高通量方法的潜力。

章节片段

动物伦理声明

所有动物实验均得到了中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物实验伦理委员会的批准（批准编号：250423-03-GR），并按照中国科技部关于实验动物护理和使用的指南进行。

真核细胞中的gD-Fc融合蛋白重组表达

DeepTMHMM分析预测PRV gD是一种I型膜蛋白，包含N端信号肽和C端跨膜区域（图1A）。根据预测的胞外结构域，设计了三种gD截短策略，包括全长gD、gD_1–354和gD_18–354（图1B）。为了比较不同gD截短策略的表达效率，这三个带有Strep标签的gD构建体使用pcDNA3.1转染并在BHK-21细胞中表达。

讨论

gD蛋白是PRV包膜的重要组成部分。它与细胞受体相互作用，参与病毒附着，并在膜融合过程中发挥不可或缺的作用[2], [18]。此外，它具有很高的免疫原性，比其他糖蛋白（如gB和gC）[26], [27], [28]诱导更强的中和抗体反应。值得注意的是，不同PRV株中的gD蛋白具有较高的保守性。BLAST分析显示，HLJ8株的gD蛋白具有...

结论

本研究成功生成了三种高亲和力的单克隆抗体1B5、1H6和2C11，它们针对PRV gD的构象表位。利用mAb 1B5和1H6的强中和活性，我们开发了一种高灵敏度和特异性的bELISA来检测抗gD中和抗体。该检测方法可作为评估疫苗诱导的保护免疫力和监测接种PRV猪株后免疫状态的血清学平台。

CRediT作者贡献声明

魏紫怡：撰写——原始草案、数据可视化、结果验证、软件开发、实验设计。杨永波：撰写——原始草案、数据可视化、软件开发。陈天锋：结果验证。齐宝杰：结果验证。沈学刚：数据可视化、实验设计。孙明珠：实验资源协调。唐岩东：实验资源协调。王书杰：撰写——审阅与编辑、实验监督、资源管理、项目规划、资金申请、数据管理、概念构思。安东青：撰写——审阅与编辑。

资助

本研究得到了中国农业科学院创新计划（CAAS-CSLPDCP-202301）和国家自然科学基金会（32273018）的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。

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