一种结合白蛋白结构域与GLP-1类似物的开发：结构特征、受体激活机制及功能研究

《International Journal of Biological Macromolecules》：Development of an albumin-binding domain-fused GLP-1 analog: Structural insights, receptor activation, and functional characterization

　　

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  GLP-1被融合到一个截短的Alb8-GA白蛋白结合域（ABD）上。
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  GLP-1-ABD保留了α-螺旋结构，并与HSA形成了复合物。
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  GLP-1-ABD激活GLP-1R的效果与利拉鲁肽相当。
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  GLP-1-ABD在MIN6细胞中增强胰岛素分泌的效果与利拉鲁肽相当。
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  GLP-1-ABD在糖尿病大鼠模型中改善了葡萄糖耐受性。

引言

糖尿病和肥胖是全球主要的、日益普遍的健康挑战。2022年，全球约有8.3亿人患有糖尿病，而1990年这一数字约为2亿人，同时受肥胖影响的人数超过了10亿[1]。目前的肠促胰岛素疗法包括胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RAs）和双葡萄糖依赖性胰岛素分泌肽（GIP）/GLP-1激动剂，这些疗法不仅在降低血糖方面具有临床益处[2]。GLP-1R的刺激以葡萄糖依赖的方式促进胰岛素释放，同时抑制胰高血糖素的分泌，延缓胃排空，并增加中枢介导的饱腹感。据报道，GLP-1R在多个器官和组织中都有表达，包括胰腺、心血管系统、胃肠道、肾脏和大脑。因此，实验和临床证据表明GLP-1R的激活具有心血管保护、肾脏保护、抗炎和神经保护作用，支持这一类药物的更广泛治疗潜力[3]、[4]。尽管具有这种广泛的药理特性，然而天然的GLP-1在循环系统中的半衰期仅为约1-2分钟，这主要是由于快速的DPP-4介导的降解和肾脏清除[5]、[6]。因此，已经开发出多种方法来延长GLP-1的活性，包括通过氨基酸序列修饰减少酶促降解、通过融合或聚合物偶联增大分子大小，以及与血清白蛋白的可逆结合以利用其延长的循环时间和FcRn介导的再循环[7]、[8]、[9]、[10]。这些发展促成了可用于临床的长效肠促胰岛素疗法的出现，例如每周一次的semaglutide和双GIP/GLP-1激动剂tirzepatide，用于管理2型糖尿病[11]。

具有强HSA亲和力的白蛋白结合域（ABDs）可以用来改善肽和蛋白质的药代动力学特性。ABDs是具有强HSA亲和力的小三螺旋蛋白结构域，可以增强分子稳定性并降低肾脏清除率[12]。其中，Alb8-GA是一个特征明确的ABD，具有小的三螺旋结构，可用于延长蛋白质和肽的血浆半衰期[13]。因此，开发结合ABD的新型嵌合GLP-1（7-37）蛋白代表了朝着具有更好稳定性和同等效力的下一代肠促胰岛素疗法迈出的有希望的方向[7]、[14]、[15]。在本研究中，我们通过将GLP-1与截短的Alb8-GA形式进行基因融合来设计GLP-1嵌合体（图1）。

我们假设结合截短的ABD可以产生一个稳定性增强但仍保持降糖活性的工程化肠促胰岛素。这一假设通过测量表达GLP-1R的重组CHO-K1细胞内的cAMP反应和在小鼠胰腺β细胞模型中的胰岛素分泌来实验验证。同时进行了计算分析，以表征工程蛋白与GLP-1R的相互作用。随后在糖尿病大鼠模型中评估了其降糖活性，并使用实验和分子建模方法研究了其与HSA的结合情况。

章节片段

载体设计、克隆和表达

设计了一个用于在pET-28b(+)中表达的重组编码序列[16]。该构建体通过将白蛋白结合域的第1个螺旋替换为[Arg34] GLP-1(7-37)来生成，同时保留ABD的第2和第3个螺旋，形成GLP-1-ABD[17]。为了便于重组生产，将该序列与人类αB-晶体蛋白（αB-Cry）连接，生成前体αB-GLP-1-ABD。NcoI和NotI限制性酶位点被用来插入表达质粒中。在NdeI位点（5′-CATATG-3′）内编码了一个甲硫氨酸残基，以创建一个用于CNBr介导目标释放的位置

GLP-1-ABD的基因设计、蛋白质表达和纯化

通过将[Arg34] GLP-1(7-37)的编码序列与Alb8-GA的第2和第3个螺旋结合，在基因水平上对GLP-1-ABD进行了工程改造，从而产生了含有ABD HSA结合区域的重组肠促胰岛素。为了提高细菌生产效率，GLP-1-ABD序列与人类αB-晶体蛋白融合表达。在NdeI位点内编码的甲硫氨酸位于αB-晶体蛋白和GLP-1-ABD之间，以创建一个用于CNBr介导目标释放的位置

讨论

之前已经使用多种结构和生物物理学方法研究了ABD与HSA的结合，特别是X射线晶体学、溶液NMR和等温滴定量热法[13]、[17]、[71]、[72]、[73]。这些研究共同定义了天然ABD-HSA复合物的主要相互作用表面和结构特征，为评估工程化的GLP-1-ABD构建体是否保留了特征性的白蛋白结合模式提供了实验参考。

在

结论

本研究发现表明，结合截短的白蛋白结合域可以在实验条件下保持GLP-1R激动剂的活性，同时实现与HSA的可测量相互作用和持续的降糖效果。与利拉鲁肽等脂质修饰的GLP-1类似物不同，GLP-1-ABD可以作为单一融合构建体进行重组生产。受体激活、白蛋白结合、细胞和体内结果的结合进一步支持了这一结论

CRediT作者贡献声明

Mohammad Reza Abolhassan：撰写——原始草稿、可视化、软件使用、实验研究、数据分析。Zamara Mariam：撰写——审阅与编辑、可视化、软件使用、实验研究、数据分析。Arpita Prasad：撰写——审阅与编辑、实验研究、数据分析。Mohammad Bagher Shahsavani：撰写——审阅与编辑、软件使用、实验研究、数据分析。Omid Niazi：数据分析。Issa Zarei：软件使用、数据分析。Giuseppe Deganutti：撰写——

伊朗国家科学基金会（INSF，拨款编号4041782）和德黑兰大学的支持。

Mohammad Reza Abolhassan|Zamara Mariam|Arpita Prasad|Mohammad Bagher Shahsavani|Omid Niazi|Issa Zarei|Giuseppe Deganutti|Ashutosh Kumar|Massoud Amanlou|Ali Akbar Moosavi-Movahedi|Reza Yousefi