B细胞与髓系细胞的TLR2表达对土拉弗朗西斯菌脂蛋白抗体应答的贡献

《The Journal of Immunology》：TLR2 expression by B and myeloid cells contributes to the antibody response against Francisella tularensis lipoproteins

　　

摘要专业翻译 细菌脂蛋白是强效的TLR2激动剂，具有显著的免疫原性活性。然而，B细胞或其他细胞类型的TLR2表达如何促进针对这些抗原（Ags）的体液免疫应答尚不清楚。本研究证明，在没有佐剂的情况下，土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）脂蛋白Tul4和FTT1103的免疫原性依赖于其脂质部分，并且部分依赖于TLR2。腹腔注射Tul4和FTT1103免疫可同时激发T依赖（TD）和T不依赖（TI）的抗体（Ab）产生，其中B细胞的TLR2表达对于TI型IgM和IgG3的产生至关重要。B细胞和髓系细胞（而非T细胞）的TLR2表达在促进TD型IgM和IgG产生中发挥主要作用，但IgG1的诱导不依赖于TLR2。用Tul4或FTT1103免疫的小鼠能够抵抗兔热病（tularemia），而用去酰基化蛋白免疫则无效。本研究首次证明，据研究人员所知，B细胞内源性TLR2表达对于抗细菌脂蛋白的体液免疫应答至关重要。这些结果可能有助于设计更先进的针对兔热病及其他感染的疫苗。

论文解读文章

研究背景与研究目的

适应性免疫应答的激活关键依赖于先天免疫。Toll样受体（TLRs）作为模式识别受体（PRRs），可识别多种微生物产物，触发炎症介质和共刺激分子的表达，这对抗原呈递和初始淋巴细胞的激活至关重要。TLRs不仅由先天免疫细胞表达，也由T细胞和B细胞表达，可能参与后者的活化和分化。然而，B细胞自身TLR表达在多大程度上是体液免疫应答所必需的，仍不完全清楚。

细菌脂蛋白是强效的TLR2激动剂，因其能激活TLR2而具备内在免疫原性，可作为良好的疫苗候选物。以往观点认为，细菌脂蛋白的免疫原性主要源于TLR2依赖的抗原呈递细胞（APCs）功能激活及随后的辅助性T细胞（Th）活化。但是，TLR2能否直接刺激B细胞并在体内促进B细胞活化和抗体（Ab）产生，此前未见报道。土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）是一种革兰阴性菌，可引起严重的兔热病。该菌拥有非典型的脂多糖（LPS），不能刺激TLR4，缺乏促炎活性，但其引发的先天免疫应答主要由TLR2介导。研究人员前期鉴定了两种土拉弗朗西斯菌脂蛋白Tul4和FTT1103，它们能强力激活TLR2/TLR1异源二聚体并诱导促炎细胞因子分泌。本研究旨在深入探究这些脂蛋白引发体液免疫应答的具体机制，特别是B细胞内源性TLR2表达在此过程中的作用。

主要技术方法

1. 1.
   基因敲除小鼠模型：使用了野生型（WT）、Rag1^-/-、Ighm^-/-（μMT）、Tlr2^-/-、Tcra^-/-、Tlr2^fl/fl、LysM^Cre 和 Cd19^Cre/Cre 等不同基因型的小鼠，并通过杂交获得 LysM^Cre/Tlr2^fl/fl（髓系特异性TLR2敲除）和 Cd19^Cre/+/Tlr2^fl/fl（B细胞特异性TLR2敲除）小鼠。
2. 2.
   重组脂蛋白纯化与突变体构建：在大肠杆菌中表达并纯化了重组His₆标记的土拉弗朗西斯菌脂蛋白Tul4和FTT1103及其去酰基化半胱氨酸突变体（Tul4Cys和FTT1103Cys）。
3. 3.
   过继转移实验：从腹腔中分离全B细胞（pan-B cells），过继转移到 Rag1^-/- 或 μMT 小鼠体内，以重建主要由B1细胞组成的B细胞区室。
4. 4.
   混合骨髓嵌合体：通过将 Cd4^-/- 骨髓细胞与WT或 Tlr2^-/- 骨髓细胞混合，移植到亚致死辐照的 Rag1^-/- 小鼠体内，构建了T细胞特异性TLR2缺陷或正常的嵌合小鼠。
5. 5.
   体外B细胞刺激与流式细胞术：分离脾脏B细胞进行体外刺激，检测细胞因子分泌和活化标志物（CD69、CD80/86、MHC-II）表达，并通过流式细胞术分析B细胞亚群。

研究结果

1. 土拉弗朗西斯菌脂蛋白是自身佐剂抗原

通过腹腔注射无佐剂的纯化Tul4或FTT1103免疫WT小鼠，发现两者均能诱导产生抗原特异性IgM和IgG。IgM水平迅速升高，在第7天达到峰值，随后下降；而IgG水平上升较慢，在加强免疫后显著增加，符合T依赖（TD）应答特征。这表明这两种脂蛋白本身即具有强免疫原性。

2. 脂蛋白的免疫原性依赖于其脂质修饰

将脂蛋白脂盒中的半胱氨酸残基突变（Tul4Cys和FTT1103Cys）以消除脂质修饰后，突变蛋白完全丧失了诱导抗体产生的能力。即使在铝佐剂或Pam3CSK4（一种TLR2激动剂）存在下，突变蛋白诱发的抗体应答也弱于天然酰基化蛋白。这证明脂蛋白的免疫原性严格依赖于其脂质部分。

3. 脂蛋白的免疫原性部分依赖于TLR2

用Tul4免疫 Tlr2^-/- 小鼠，其抗原特异性IgM和IgG3的产生显著（但非完全）降低，IgG2b和IgG2c受影响较小。值得注意的是，IgG1的产生虽然需要酰基化，但却不依赖于TLR2。此外，体外实验表明，Tul4或FTT1103可直接激活纯化的脾脏B细胞，诱导细胞因子分泌和活化标志物上调，该效应依赖于TLR2。

4. Tul4特异性IgM是T不依赖性的，而其他Ig同种型需要αβ T细胞帮助

免疫 Tcra^-/-（缺乏αβ T细胞）小鼠发现，Tul4特异性IgM的产生与WT小鼠相当，而所有IgG同种型（除微量IgG3外）均无法检测到。这表明Tul4既可作为T不依赖（TI）抗原诱导IgM，也可作为T依赖（TD）抗原诱导IgG类别转换。

5. TLR2在B细胞表达的TI型Tul4特异性IgM和IgG3分泌中起关键作用

将WT或 Tlr2^-/- 小鼠的腹腔全B细胞（主要为B1细胞）过继转移到 Rag1^-/- 小鼠体内。只有接受WT B细胞的小鼠在Tul4免疫后能产生特异性IgM和IgG3，而接受 Tlr2^-/- B细胞的小鼠则不能。这表明B细胞（很可能是B1细胞）内源性TLR2表达对TI型IgM和IgG3应答至关重要。

6. B细胞和髓系细胞的TLR2表达共同促进Tul4特异性抗体应答

利用条件性基因敲除小鼠，研究发现B细胞特异性缺失TLR2（Cd19^Cre/+/Tlr2^fl/fl）或髓系细胞特异性缺失TLR2（LysM^Cre/Tlr2^fl/fl）均会导致Tul4特异性IgM、IgG2b和IgG3水平显著下降。而T细胞特异性TLR2缺失对抗体应答无影响。这表明TLR2在B细胞和髓系细胞上的表达共同促进了针对脂蛋白的TD和TI抗体应答。

7. 用Tul4或FTT1103免疫可预防兔热病

用Tul4或FTT1103免疫的WT小鼠在感染土拉弗朗西斯菌LVS后，存活率更高，体重减轻更少，器官细菌载量更低。这种保护作用依赖于脂蛋白的酰基化，因为用突变蛋白免疫无法提供有效保护。进一步实验表明，被动转移含有TI型抗体（IgM和IgG3）的免疫血清也能提供保护，证实了这些抗体在防御中的作用。

讨论总结与结论

本研究首次证明了B细胞内源性TLR2表达在抗细菌脂蛋白的体液免疫应答中发挥着关键作用。具体而言，土拉弗朗西斯菌脂蛋白Tul4和FTT1103既能作为T不依赖（TI）抗原，也能作为T依赖（TD）抗原。其诱导的TI型IgM和IgG3应答高度依赖于B细胞自身的TLR2表达，而TD型IgG应答则需要B细胞和髓系细胞共同表达TLR2。相比之下，T细胞上的TLR2并非必需。这一发现挑战了过去仅将脂蛋白免疫原性归因于APC激活的传统观点，揭示了TLR2直接作用于B细胞的重要性。该研究为理解TLR信号在B细胞生物学中的作用提供了新的见解，并为开发更有效的兔热病及其他感染性疾病的疫苗策略（如利用脂蛋白作为自身佐剂抗原）奠定了理论基础。