结构引导竞争分配框架IsoPrism实现短读转录组异构体使用预测

《Briefings in Bioinformatics》：IsoPrism predicts isoform usage from short-read transcriptomes through structure-guided competitive allocation

　　

短读（SR）单细胞与空间转录组学可表征基因表达，但对基因内异构体使用的解析分辨率有限。研究人员提出IsoPrism，一种结构引导的竞争分配框架，可从基因水平表达预测异构体比例。IsoPrism将个体表达与局部表达上下文同转录本结构注释相结合，采用共享迭代更新以保持非负、基因归一化的比例。来自个体长读（LR）计数与组水平异构体使用的联合监督使模型能够在缺乏匹配LR测量的样本中进行预测。在源自三个配对转录组资源的五种迁移场景中，IsoPrism在八种评估方法中取得了最高的平均主导异构体准确率、组成相似性和簇水平分配相关性。消融分析支持结构查询、表达上下文、迭代分配与双分辨率监督的互补贡献。应用于发育中小鼠皮层图谱时，IsoPrism识别出与阶段和细胞类型相关的异构体使用模式，包括两个Pkm转录本预测相对使用的变化。IsoPrism通过从配对LR参考迁移信息，实现了对SR转录组的异构体使用分析，扩展了现有单细胞与空间基因表达图谱的分析价值。

**研究背景与问题**　异构体使用描述同一基因所产生转录本的相对贡献，提供了超越总基因表达的细胞变异视角。可变剪接与可变转录本末端加工产生的异构体使用可在细胞类型、发育阶段和疾病状态间存在差异。单细胞RNA测序与空间转录组学为研究此类变异提供了互补场景，但广泛使用的短读（SR）方案主要采样转录本末端，对全长转录本组成信息有限。长读（LR）测序可在单个分子内连接远距离转录本特征，脑、结直肠癌及空间 profiling 心肌的配对短读与长读研究已实现异构体分辨分析，并为将异构体水平研究扩展至缺乏匹配LR测量的SR数据集提供了参考。现有计算方法针对转录本水平分析的不同方面：基于读段的方法（如Salmon、BRIE2）依赖转录本或事件信息性观测，这些信息在已处理的基因表达矩阵中并不保留，其推断任务与仅从基因水平表达预测异构体使用不同；单细胞跨模态方法（如BABEL、scButterfly）学习已测分子谱间关系以预测未测模态，但将其应用于异构体使用需超越将每个转录本视为独立输出的做法——转录本共享父基因与结构特征，其相对比例必须在每个基因内联合解读。该预测任务面临若干挑战：基因水平表达总量不能唯一确定其异构体组成；异构体比例相互依赖，须保持非负且和为1；稀疏且不均的LR覆盖限制了单细胞水平监督，需利用多分辨率信息；部署时目标群体可能在供体、组织状态、研究或测序平台上与参考不同。因此需要一种结合表达上下文与转录本结构、并尊重输出组成性质的模型。

**研究内容与结论**　研究人员提出IsoPrism，一种从SR单细胞与空间基因表达谱预测基因内异构体比例的结构引导框架。IsoPrism将个体表达与表达衍生的局部上下文编码为潜在程序表示，结构感知的异构体查询将这些表示与保留的转录本目录连接，共享竞争更新细化每个基因内转录本间的分配。训练时利用配对LR测量进行细胞与上下文水平的联合监督，而推断仅需SR表达与保存的结构注释。研究人员在源自三个配对资源的五种迁移设置中，将IsoPrism与七种比较方法进行评估，并通过消融与敏感性分析检验其组分，进一步将预训练模型应用于发育中小鼠皮层图谱以提名阶段与细胞类型相关的异构体使用模式。结果表明，IsoPrism在五种场景的三个指标上均取得最高平均分，消融分析证实转录本结构、表达上下文、迭代分配与双分辨率监督的互补贡献，下游应用识别出包括Pkm两个转录本相对使用变化在内的发育与细胞类型相关模式。该研究的意义在于建立了利用配对LR参考研究SR转录组异构体组成的框架，通过从配对LR参考迁移信息，扩展了现有基因水平图谱的分析价值，使跨细胞类型与发育阶段的异构体使用变异研究成为可能。

**主要关键技术方法**　研究人员构建了五个迁移场景，数据来源为三个公开配对转录组资源：人结直肠癌（CRC）异构体图谱（10× Illumina表达谱配对PacBio异构体计数）、人FLAMES数据集（Illumina配对Oxford Nanopore Technologies（ONT）异构体计数）以及心肌梗死后小鼠心脏空间数据集（Illumina配对ONT Visium）。方法包括：按细胞条形码或条形码与切片匹配配对矩阵；跨研究在GRCh38参考上按父基因、染色体、链与完整内含子链协调LR目标；基于线性SR表达离散度筛选输入基因（至多2000个）；采用随机主成分分析（PCA）与K-means构建表达衍生局部上下文；模型包含表达条件化程序表示、结构感知异构体查询与共享竞争分配更新；以条件多项负对数似然（cell NLL）与簇交叉熵（cluster CE）进行双分辨率联合监督；采用AdamW优化并在源验证分区选择学习率与训练时长；评估指标包括基因宏平均主导异构体准确率、基于Jensen–Shannon散度（JSD）的组成相似性与簇水平Spearman相关；下游应用将E18小鼠脑数据（GSE130708）预训练模型不经再训练应用于发育中小鼠体感皮层图谱（GSE153162）的82 227个野生型细胞。

**研究结果**　（1）IsoPrism概览：模型通过四阶段工作流，结合表达衍生局部上下文与已知异构体结构注释，预测基因内非负且和为1的比例；训练后的模型在部署时无需LR测量，直接上下文水平预测使用组均值表达。（2）IsoPrism在五个迁移场景中改善异构体使用预测：在跨供体、跨数据集、正常到肿瘤、跨平台与空间转录组评估中，IsoPrism在三个指标上均取得最高平均分；相对各指标与场景的最强比较方法，主导异构体准确率提高0.85–2.35个百分点，组成相似性提高0.0272–0.0415，簇水平Spearman相关提高0.0161–0.0601；CRC到FLAMES迁移中组成相似性从scButterfly的0.8289升至0.8704，Spearman相关从0.7312升至0.7913；空间评估中spot–gene 1?JSD达0.8137（scButterfly为0.7833）。（3）消融与敏感性分析揭示互补组分贡献：以学习目标身份替换结构查询在五个设置中降低全部三项指标，跨数据集迁移中主导准确率从0.7389降至0.7085、组成相似性从0.8704降至0.8462；去除末端描述符在跨供体、正常到肿瘤与空间评估中降低性能；去除局部表达上下文使1?JSD降低0.0251–0.0382，主导准确率降低0.43–0.73个百分点；仅细胞损失使簇水平Spearman相关降低0.0357–0.0508，为受试组分消融中最大降幅；单次分配更新相对四步模型降低全部三项指标，八次更新未带来一致额外增益；性能随潜在程序数与非零簇损失权重适度变化，默认配置接近性能平台。（4）IsoPrism在小鼠皮层图谱中识别发育性异构体使用模式：预训练模型不经再训练应用于82 227个细胞、跨越E10.5至P4共12个阶段；Pkm预测转录本偏好从编码PKM2的ENSMUST00000034834.15向编码PKM1的ENSMUST00000163694.3发生发育转换，E10.5–E13.5偏好PKM2编码转录本，E14.5–E16接近平衡，E17.5至P4偏好PKM1编码转录本；细胞类型汇总显示未成熟神经元、上层与深层兴奋性神经元、中间神经元及Cajal–Retzius细胞偏好PKM1编码转录本，放射状胶质细胞、星形胶质细胞与循环祖细胞明显偏好PKM2编码转录本，小胶质细胞与内皮细胞呈同向但较温和的偏好，少突胶质谱系、红系细胞与中间祖细胞平均分配较均衡；Map2、Frmd4a、Cadm1显示早期 predominant 转录本相对使用降低，Srrm1显示转录本偏好广泛逆转，Malat1保持同一 predominant 转录本但其预测份额在后期更高。

**讨论与结论**　IsoPrism的核心贡献在于将预测表述为同一基因内转录本间的竞争分配，而非将转录本视为独立输出；结构感知异构体查询将父基因关系、剪接连接与转录本描述符同个体表达及表达衍生局部上下文表示相连，共享迭代更新在保持基因内非负且和为1比例的同时细化分配，细胞与上下文水平联合监督结合个体LR计数与组水平使用目标。消融分析证明转录本结构、表达上下文、迭代分配与双分辨率监督的互补贡献；八个评估方法中IsoPrism在三项互补指标上均最高，表明改进超越识别主要转录本而扩展至估计完整基因内组成，且跨供体、研究、组织状态与空间切片迁移均观察到增益。小鼠皮层应用显示预测Pkm使用的时间模式与既往报道的发育性Pkm转换及人神经元分化中PKM2到PKM1转换一致，神经元–星形胶质细胞对比与纯化小鼠皮层细胞及原代人星形胶质细胞观察一致，支持预测模式的生物学相关性；Map2、Frmd4a、Cadm1、Srrm1与Malat1的多样阶段相关再分配模式凸显检查完整基因内组成的价值。局限包括：预测限于保留的转录本目录，无法发现未表征转录本；应用于新数据集依赖从配对参考学习到的表达–使用关系的可迁移性；发育皮层应用缺乏配对LR验证，其预测模式需LR测序或靶向异构体测定确认；未来工作可纳入序列水平调控特征与空间邻域信息。总之，IsoPrism结合转录本结构、表达上下文与基因内竞争分配，从SR单细胞与空间转录组预测异构体使用；通过从配对LR参考迁移信息，扩展了现有基因水平图谱的分析价值，使跨细胞类型与发育阶段的异构体使用变异研究成为可能。