工程化CRISPR/Cas系统：用于增强生物传感的多层次优化策略

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Engineering CRISPR/Cas systems: Multilevel optimization strategies for enhanced biosensing

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  提出了一种用于工程化CRISPR/Cas生物传感器的综合框架。
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  综述了Cas蛋白、gRNA、激活剂和信号报告分子的最新进展。
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  强调了分子工程如何克服天然CRISPR/Cas系统的局限性。
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  讨论了工程化CRISPR/Cas生物传感器的未来挑战和前景。

章节摘录

引言

成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR/Cas）系统最初是作为细菌的一种适应性免疫机制进化而来的。由于其显著的特异性、灵敏度和可编程性，CRISPR/Cas技术彻底改变了分子诊断领域，成为食品安全、环境监测和临床诊断的核心分析工具[1][2]。值得注意的是，像Cas12、Cas13和Cas14这样的效应蛋白表现出...

CRISPR/Cas效应蛋白的分类和工作机制

根据效应模块的架构，CRISPR/Cas系统大致分为两类和多种类型。I类（Type I、III和IV）系统使用多蛋白复合体来干扰目标，而II类（Type II、V和VI）系统则依赖单一效应蛋白，这极大地促进了它们在生物技术应用中的重新利用[35][36]。对于生物传感而言，II类效应蛋白因其简单性和稳健性而受到关注...

通过重新编程Cas蛋白的催化核心以提高检测能力

CRISPR/Cas系统通过提供卓越的可编程性和精确的核酸识别能力，彻底改变了分子生物学。它们强大的目标识别能力和可靠性也推动了新型核酸检测平台的发展[69][70][71]。尽管在检测应用中具有巨大潜力，但天然Cas蛋白存在固有的局限性，包括灵敏度受限、目标范围狭窄和热稳定性差...

工程化gRNA以提高生物传感性能

作为CRISPR系统的关键组成部分，gRNA（在此统称为Cas12a/Cas13系统的crRNA和Cas9/Cas12b/Cas14系统的sgRNA）通过互补碱基配对将Cas蛋白引导至特定的DNA或RNA序列。对gRNA进行工程改造已成为提高基于CRISPR/Cas的生物传感器性能的有效策略，包括增强灵敏度、特异性和稳定性等...

工程化激活剂以提高生物传感性能

如第3节所讨论的，克服天然Cas效应蛋白对PAM/PFS的依赖性是CRISPR生物传感器工程的主要目标。虽然蛋白质工程通过重新编码与PAM相互作用的域（PI domain）来拓宽目标范围，提供了一种“硬件级”解决方案，但这种方法存在固有的局限性。突变PI域往往会导致适应性成本，即旨在放宽序列限制的结构变化可能无意中降低酶的固有稳定性...

工程化报告分子以提高灵敏度和多功能读数

报告分子充当信号放大器，负责将Cas核酸酶活性转化为可检测的信号。传统的单链DNA报告分子（如FQ报告分子）通常存在高背景噪声、稳定性低和扩增能力不足的问题，这限制了CRISPR/Cas系统的灵敏度和实用性。最近的工程改进通过结构优化、化学修饰和功能集成显著提升了它们的性能[181]...

结论与展望

本综述系统总结了工程化CRISPR/Cas系统作为下一代分子诊断工具包的突破（见表4），这标志着生物传感领域的一个重大转变。传统基于CRISPR的方法往往受到天然CRISPR/Cas系统固有的功能和活性限制。为了提升基于CRISPR/Cas的生物传感性能，研究人员正在通过工程改造Cas蛋白、gRNA、激活剂等组件来开发一系列高性能工具...

CRediT作者贡献声明

王光强：撰写——审稿与编辑，数据分析。 谢凡：撰写——审稿与编辑，数据分析。 于莹：撰写——审稿与编辑，初稿撰写，研究开展，资金筹集。 张娟：撰写——审稿与编辑，研究开展。 宋欣：撰写——审稿与编辑，数据分析。 彭赤芳：监督。 艾连忠：撰写——审稿与编辑，监督，资金筹集，数据分析。

数据可用性

本文所述研究未使用任何数据。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了以下机构的支持：国家自然科学基金（项目编号：32402043）、上海市教育委员会科学研究创新项目（项目编号：202101070007E00120）、中国博士后科学基金会（项目编号：2025T180820）以及上海市食品微生物工程研究中心（项目编号：19DZ2281100）。

于莹|王光强|谢凡|宋欣|彭赤芳|张娟|艾连忠