《PLOS Biology》：LEM-3/ANKLE1 nuclease prevents the formation of abnormal syncytium to safeguard neuronal differentiation
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在动物发育中，细胞在最后一轮细胞分裂后退出细胞周期，以分化为特化细胞类型。然而，胞质分裂（cytokinesis）失败对分裂后细胞（postmitotic cells），尤其是神经元（neurons）命运特化的影响仍知之甚少。研究人员分析了缺乏中体锚定核酸酶（
在动物发育中，细胞在最后一轮细胞分裂后退出细胞周期，以分化为特化细胞类型。然而，胞质分裂（cytokinesis）失败对分裂后细胞（postmitotic cells），尤其是神经元（neurons）命运特化的影响仍知之甚少。研究人员分析了缺乏中体锚定核酸酶（midbody-tethered endonuclease）LEM-3/ANKLE1的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）突变体，该核酸酶在胞质分裂过程中解离染色质桥（chromatin bridges）。利用遗传分析、荧光显微镜和RNA可视化，研究人员发现未解离的DNA桥导致稳定的胞间桥（intercellular bridges）形成，在触觉受体神经元（touch receptor neurons, TRNs）与姐妹细胞（sister cells）之间形成双核合胞体（binucleate syncytia），尽管核转录独立，该结构仍允许充分的细胞质混合（cytoplasmic mixing）。在某些情况下，姐妹细胞之间的细胞质连接还导致神经元命运（neuronal fates）受到抑制以及凋亡命运（apoptotic fates）被阻止。因此，LEM-3阻止合胞体形成，以确保适当的细胞分化。
该研究聚焦动物发育中细胞终末分裂后退出细胞周期并分化为特定细胞类型的过程。姐妹细胞在发育中可采取相同命运，但多数情况下采取不同终末命运或一为分化命运、一为祖细胞命运；胞质分裂失败对分裂后细胞（postmitotic cells），尤其是神经元命运特化的影响仍不清楚。LEM-3是进化保守的LEM结构域蛋白，含N端Ankyrin重复和C端核酸内切酶结构域，人类同源物为ANKLE1。LEM-3定位于中体（midbody），在胞质分裂（cytokinesis）晚期解离由DNA复制不完全、重组中间体持续或染色体凝缩/解离缺陷所致的染色质桥（chromatin bridges）。持续染色质桥可延迟胞质分裂，并在持续分裂细胞中最终被肌动球蛋白收缩力切断；但在产生分裂后细胞的终末分裂后，染色质桥是否断裂、细胞间连接是否解除尚不明确。正常多核合胞体可见于秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）皮下、缝细胞、生殖系和肌肉等同类细胞，而连接不同细胞类型的合胞体命运后果不明。为此，研究人员利用lem-3(?)突变体中未解离染色质桥造成的姐妹细胞持续胞质连接，研究其对神经元终末分化和命运特化的影响。
研究人员通过遗传筛选、突变体鉴定、CRISPR/Cas9敲除、荧光报告、单分子荧光原位杂交（single-molecule fluorescence in situ hybridization, smFISH）、光转换（photoconversion）和激光切断、药物处理及行为学实验，发现LEM-3缺失导致未解离染色质桥、胞质分裂失败和双核合胞体（binucleate syncytia）形成；合胞体中细胞质内容物充分混合而两核转录可独立，部分姐妹细胞命运被抑制、凋亡命运被阻止或延迟。由此提出LEM-3通过防止异常合胞体形成保障细胞分化，并提示LEM-3/ANKLE1在终末分化中的保守意义。
关键技术方法如下：研究使用秀丽隐杆线虫株系，包括野生型、lem-3等位突变体、CRISPR/Cas9敲除株及CGC等来源的报告株和等位株；采用正向遗传筛选与染色体定位/全基因组重测序鉴定unk14，构建lem-3(?)及mec-3(?)等突变体；用荧光报告和smFISH/smiFISH检测内源mRNA；用Dendra2光转换和UV激光切断胞间桥评估细胞质交换；结合ICRF-193、mcm-7 RNAi及微管、肌动蛋白、ROCK抑制剂处理，并进行板降和轻触行为实验。
研究结果：1. lem-3缺失导致TRNs与姐妹细胞经胞间桥形成双核合胞体。正向筛选获得unk14（V618M），定位至lem-3；mn155(R190*)及CRISPR敲除unk84/unk85重现额外TRN标记细胞，lem-3(+)转基因可挽救；25 °C下AVM-SDQR合胞体约10%–20%，PVM-SDQL低于3%，ALM-BDU约5%，PLM-ALN亦有发生；ALM-BDU中BDU命运受抑制但不完全，PLM-ALN中ALN命运被抑制并转为PLM样。2. MEC-3异位存在使TRN姐妹细胞转为TRN样命运。用unc-119p::mec-3广谱过表达可激活TRN标记并抑制姐妹标记；lem-3(?);mec-3(?)双突变中合胞体不再表达TRN标记而表达姐妹标记，支持MEC-3经胞间桥扩散并通过与UNC-86/PAG-3竞争影响命运。3. 合胞体中两核具有独立转录程序。smFISH显示多数AVM-SDQR合胞体仅AVM核转录TRN基因、SDQR核转录SDQ基因，约15%两核均转录TRN基因；ALM-BDU两核均转录TRN基因且BDU基因受抑制，PLM-ALN两核转录TRN基因且多数ALN基因受抑制但ast-1持续，提示两核转录组不必同步。4. 物理连接细胞间发生细胞内容物混合。GFP mRNA仅见于AVM而GFP蛋白充满合胞体；AVM内Dendra2光转换后数分钟SDQR出现红色信号，激光切断桥后不再增加；胞质、核、膜、ER、突触囊泡和线粒体相关蛋白在两胞体均匀分布并保持亚细胞定位。5. 未解离染色质桥与相连核膜导致胞间桥形成。升温、mcm-7 RNAi和ICRF-193增加AVM-SDQR与PLM-ALN合胞体；桥内含DAPI DNA、H2B及核膜标记LMN-1、EMR-1；核膜连接在终末分裂后立即形成并可持续数天，桥可由约6 μm伸长至约27 μm，ALM-BDU桥可超过100 μm；LEM-3核酸酶活性位点Y556A G558A、Aurora B磷酸化位点S192A S194A及air-2突变均导致合胞体，而xpf-1、mus-81、slx-1相关突变未见该表型。6. 胞间桥含细胞骨架结构。ZEN-4标记的中体与LEM-3::GFP共定位；lem-3(?)中体形成并持续数小时，约6小时后消失；MAPH-1.1::GFP显示微管持续存在，LifeAct::GFP显示肌动蛋白；微管解稳剂colchicine和稳定剂taxol均降低AVM-SDQR合胞体，ROCK抑制剂Y-27632增加合胞体，Latrunculin A不影响，提示微管支撑及肌动球蛋白收缩延迟或中止参与桥维持。7. AVM与其姐妹细胞连接产生功能后果。板降实验中野生型95%表现逆转，而伴AVM-SDQR合胞体的lem-3(?)仅62%逆转、30%无反应；其轻触敏感性与野生型相似，提示前部偏倚消失，原文认为合胞体增大可能稀释神经信号并提高激活阈值。8. lem-3(?)中凋亡与非凋亡细胞连接。约25% AVM-SDQR合胞体含第三细胞体，来自QR.pp凋亡姐妹，含核膜和中体但不转录TRN基因；三体合胞体频率随发育下降，ced-3(?)中持续，提示凋亡命运被延迟而非逆转；AQR、PQR等与凋亡姐妹形成合胞体（2%–3%）并罕见出现神经元标记丢失，ced-3(?)可见AQR、PQR、OLL邻近额外细胞。9. LEM-3保障多种神经元类型的特化。分析11个产生两种不同神经元命运的终末分裂（CEPD-URX、SMDD-AIY、SMDV-BAG、ASJ-AUA、ADF-AWB、HSN-PHB、AFD-RMD、ADE-ADA、PDE-PVD前体、FLP-AIZ、RIS-DB4），多数可见合胞体或命运标记丢失且外显率低；RIS无明显表型但ICRF-193处理约20%形成合胞体；CEPD-URX中URX合胞体与CEPD标记丢失一致；DVB（与直肠细胞）和PVR（与hyp7）亦见命运抑制或合胞体，提示多种命运易受姐妹细胞选择因子影响。
讨论与结论：该研究揭示LEM-3在终末分化前最终分裂中保障姐妹细胞分离的作用。LEM-3缺失使染色质桥未解，胞质分裂失败，形成两个细胞体经桥相连的“双体”合胞体，表现为细胞多倍体而非核多倍体，符合LEM-3作为中体锚定核酸酶“最后机会”解离DNA桥的机制。与持续分裂细胞不同，终末分裂后持续染色质桥未引起机械解离或沟回退，Aurora B激酶（Aurora B kinase）依赖的NoCut通路所致分裂暂停转为永久状态，桥随两核迁移而拉伸，形成稳定胞质桥。合胞体两核可维持不同转录程序，类似单核RNA测序和空间转录组所揭示的合胞体转录异质性；但一个核转录产生的蛋白可扩散至整个合胞体，故转录差异不一定造成两胞体蛋白差异。AVM-SDQR合胞体未回复前体状态，仍可各自完成形态和分子分化，显示发育稳健性；ALM-BDU和PLM-ALN中TRN命运占优，与MEC-3扩散及对UNC-86较高亲和竞争PAG-3相关。LEM-3通过解离染色质桥防止双核合胞体，保障命运特化；lem-3(?)可作为研究姐妹细胞命运程序互作工具，其保守性提示其他生物同源物在终末分化中的作用值得探索。研究结论：因此，LEM-3阻止合胞体形成，以确保适当的细胞分化。
