CFL1依赖性表面外胚层离散细胞行为驱动小鼠脊髓拉链式闭合及脊柱裂易感性

《PLOS Biology》：CFL1-dependency of discrete cell behaviours driving mouse spinal zippering

　　

上皮融合（epithelial fusion）对许多胚胎组织的形成至关重要。发育中的哺乳动物脊髓通过拉链式闭合（zippering）融合，这一过程依赖F-actin（纤维状肌动蛋白）周转所驱动的细胞行为。研究人员提出一个驱动小鼠拉链式闭合进展的尾侧到头侧表面外胚层（SE）细胞行为序列，并检验F-actin切丝蛋白CFL1（cofilin-1）在这一过程中的必要性。关键的拉链推进行为包括：（i）超细胞肌动球蛋白缆索（supracellular actomyosin cables）收缩；（ii）以周期性间隔延伸丝状伪足/片状伪足（filopodial/lamellipodial protrusions）；（iii）前缘细胞边界收缩，使伪足相互靠近并在中线建立“先锋性”（pioneering）接触；（iv）细胞-细胞以及细胞-细胞外基质（ECM）黏附重塑；（vi）通过细胞伴侣交换推进拉链。在野生型胚胎中，CFL1富集于邻近拉链点的SE细胞前缘，并定位于部分伪足内。SE中条件性Cfl1缺失产生更致密的F-actin应力纤维，使丝状伪足过度稳定，削弱其可能建立新生接触的探索性运动，并损害融合点细胞的连接性收缩。条件性Cfl1缺失胚胎的拉链速度降低约30%，约30%发生脊柱裂（spina bifida）。因此，研究人员提出，丝状伪足动态性受损和连接性收缩削弱限制了驱动脊髓拉链式闭合的行为序列，易导致脊柱裂。

研究背景：上皮融合（epithelial fusion）是腭、尿道、视裂、体壁和中枢神经系统等许多组织形态发生的关键过程。小鼠脊髓神经管闭合表现为拉链式闭合（zippering），依赖F-actin（纤维状肌动蛋白）周转所驱动的表面外胚层（SE, surface ectoderm）细胞行为。既有研究已描述小鼠后神经孔（PNP, posterior neuropore）拉链点SE细胞形成半花环样组织、超细胞肌动球蛋白缆索、丝状伪足和片状伪足，并发现整合素β1（Itgb1）条件性缺失可减弱半花环边界收缩、阻滞低位脊柱拉链式闭合并导致脊柱裂；RAC1缺失可消除片状伪足并导致约90%胚胎脊柱裂。但哺乳动物上皮融合的离散细胞行为序列仍不清楚，CFL1（cofilin-1，切丝蛋白1）在其中的作用此前主要聚焦神经上皮，且全局Cfl1缺失导致早期胚胎致死和完全外显神经管缺陷，冗余及时空特异性限制了解析。CFL1受CDC42、RAC1和ROCK调控，并能切割F-actin，因此是调控SE拉链行为的优先候选因子。研究人员提出一个尾侧到头侧的SE细胞行为序列，并利用条件性基因删除解析CFL1在该过程中的细胞功能。结论是：CFL1在早期脊髓拉链式闭合时邻近拉链点的SE前缘富集，其缺失导致F-actin应力纤维更致密、丝状伪足过度稳定且探索性运动减弱、融合点细胞连接性收缩受损，拉链速度降低约30%，约30%胚胎发生脊柱裂；这表明CFL1通过增强丝状伪足动态性和维持中线SE细胞边界收缩促进上皮融合，其功能受损降低完成脊髓神经管闭合的可能性。该研究将CFL1与哺乳动物上皮融合的离散细胞行为联系起来，为脊柱裂易感性提供了细胞机制解释。

关键技术方法（不超过250字）：研究使用小鼠胚胎（E8.5–14.5，C57/BL6背景；Cfl1^Fl/Fl等位基因来源于KOMP/MMRRC），采用Cdx2^Cre/+与Grhl3^Cre/+条件性删除Cfl1，并以Rosa26-mTmG报告重组区域；进行胚胎滚动培养、DiI标记量化拉链速度；用共聚焦/AiryScan免疫荧光和表面减影分析蛋白定位；用激光烧蚀测定缆索与连接张力；用高分辨率活细胞成像追踪伪足动态与连接长度；并用ROCK、CDC42抑制剂进行短时药理学干预。

研究结果：
1. 小鼠脊髓拉链式闭合所依赖细胞行为的描述：通过三维重建和高分辨率共聚焦成像，研究显示小鼠PNP拉链点呈V形，SE细胞在神经褶边缘组装超细胞缆索并伸出富F-actin伪足，拉链点可见纤连蛋白（FN1）及紧密连接、E-钙黏蛋白黏附连接；缆索连接相邻细胞，细胞边界接近拉链点时逐渐收缩并在离开拉链点后建立新连接，从而提出尾侧到头侧的拉链推进行为序列。
2. 脊髓拉链式闭合期间CFL1的磷酸化与亚细胞定位调控：通过全胚胎免疫荧光和强度定量，发现CFL1在早期邻近拉链点的SE细胞前缘富集，且该富集随体节阶段进展而减弱；高分辨率成像显示CFL1和磷酸化CFL1（pCFL1）存在于部分而非全部伪足中；表面减影揭示pCFL1在SE细胞质中异质分布、在有丝分裂细胞中减少、在已完成拉链的中线SE细胞中富集；ROCK抑制降低pCFL1强度，且细胞水平pCFL1与F-actin平均强度呈显著负相关。
3. 早期SE中的CFL1增强拉链式闭合速度：通过Cdx2^Cre/+条件删除发现多组织Cfl1删除未产生明显神经管表型，仅少数出现扭结尾；改用Grhl3^Cre/+在早期SE删除Cfl1后，出现部分外显的无脑/露脑和脊柱裂，PNP长度在15–18体节阶段显著增加；DiI标记培养量化显示条件性缺失胚胎拉链速度较对照降低约30%；SE有丝分裂指数未变，但中线凋亡小体聚集增多，拉链点附近未见凋亡聚集，提示拉链速度下降不太可能由细胞死亡导致。
4. 拉链式闭合步骤分析鉴定CFL1促进的过程：通过激光烧蚀、反射成像、连接蛋白染色和边界收缩比分析，发现条件性缺失胚胎的缆索pMLC富集与缆索张力未降低，纤连蛋白存在，中线黏附连接和紧密连接可形成，片状伪足密度无显著差异；但丝状伪足密度显著增加，且拉链点半花环位置1细胞边界收缩显著减弱，而位置3到位置2的收缩仍存在；因此排除缆索收缩减弱、中线连接缺失、纤连蛋白缺乏或伪足减少等原因，定位到丝状伪足过量和拉链点边界收缩减弱。
5. CFL1缺失削弱丝状伪足动态性与连接收缩：通过高分辨率活细胞成像追踪伪足，发现野生型丝状伪足多为短暂结构，部分可形成并稳定先锋接触，而条件性缺失胚胎丝状伪足显著更稳定、角度变化更小，探索性运动减弱；缺失胚胎拉链点左右伪足间距更大，邻近拉链点细胞连接收缩程度低于对照；CDC42抑制1小时降低SE pCFL1强度、减少丝状伪足密度并减弱位置1边界收缩，而ROCK抑制4小时不影响该边界收缩，提示早期拉链阶段该连接收缩行为由CDC42和CFL1促进且独立于ROCK。

讨论与结论：讨论提出驱动哺乳动物脊髓拉链式闭合的空间组织化细胞行为序列，并强调CFL1在早期SE中的功能。Cdx2^Cre/+模型表型轻微，提示CFL1可能在未重组组织如心脏中起关键作用；Grhl3^Cre/+模型避免严重发育迟缓，便于机制解析。条件性缺失胚胎中线凋亡聚集体增大，但拉链点附近未见聚集，研究人员认为其不太可能影响拉链式闭合。CFL1缺失导致SE应力纤维样F-actin更致密，符合其切丝功能；pCFL1与F-actin负相关与部分体外结果不同，讨论提出高cofilin:actin比值下CFL1可促进F-actin组装等可能解释。研究未观察到连接或缆索张力及YAP核定位的量化改变，提示高张力结构可能受保护。研究将小鼠脊髓拉链式闭合与果蝇背侧闭合等比较，并讨论丝状伪足动态性、连接收缩及CDC42-CFL1负反馈假说。研究结论翻译：总之，研究人员提出驱动哺乳动物脊髓拉链式闭合进展所必需的空间组织化细胞行为序列。应用该框架，研究人员鉴定CFL1在上皮融合中的新功能：增强丝状伪足动态性并维持拉链点中线SE细胞边界的收缩。这些效应的聚合——研究人员推断丝状伪足动态性降低可能是始动缺陷——使拉链速度降低约30%，但在所测试的任何胚胎中均未完全停止。其后果是完成脊髓神经管闭合的可能性降低，导致部分外显的脊柱裂。