《PLOS Biology》：Fungal suppression by bacterial metabolite-activated human intestinal γδT-cells is disrupted in Crohn’s disease
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摘要专业翻译
肠道共生菌可塑造黏膜免疫以抵抗肠道病原体感染，但所涉及的具体微生物及机制在不同宿主物种间存在显著差异。在高等灵长类动物中，细菌代谢物HMB-PP可被一类特化的Vγ9Vδ2+T细胞群所感知。研究人员现报道，该细胞群可在人肠道器官培养模型中有效抑制内
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肠道共生菌可塑造黏膜免疫以抵抗肠道病原体感染，但所涉及的具体微生物及机制在不同宿主物种间存在显著差异。在高等灵长类动物中，细菌代谢物HMB-PP可被一类特化的Vγ9Vδ2+T细胞群所感知。研究人员现报道，该细胞群可在人肠道器官培养模型中有效抑制内源性真菌的生长。在健康肠道中，经HMB-PP刺激的Vδ2+T细胞可通过一种依赖IL-22的机制限制关键真菌白色念珠菌（Candida albicans）的过度生长。在克罗恩病（Crohn's disease, CD）中，Vδ2+T细胞对HMB-PP的应答能力低下，从而允许形成产毒素菌丝的白色念珠菌菌株过度生长，并在离体（ex vivo）条件下触发中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）及诱导巨噬细胞释放IL-1β。对白色念珠菌分离株的基因组和蛋白质组学分析提示，源自CD的菌株组织黏附能力增强，其可在“肠芯片”（intestine-on-a-chip）模型中快速侵袭肠道屏障。上述数据揭示，细菌激活Vδ2+T细胞可通过一种IL-22依赖机制抑制人肠道中的真菌致病共生菌（pathobionts），而该机制在CD中发生失调。
论文解读
一、研究背景与科学问题
肠道共生微生物通过塑造黏膜免疫来抵御病原体入侵并限制感染相关的组织损伤，但不同宿主物种之间，参与这一过程的具体菌种与分子机制差异显著。在人类肠道中，白色念珠菌（Candida albicans）是常见的共生酵母，但当宿主环境发生变化时，该菌可转变为组织侵袭性菌丝形态，分泌念珠菌溶素（candidalysin, CLYS）毒素并破坏上皮屏障。白色念珠菌对肠道组织的侵袭及其对驻留白细胞的损伤，目前被认为在炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）的发病中发挥重要作用，并可在免疫受损患者中进展为播散性感染，死亡率超过50%。世界卫生组织已将该菌种列为关键优先级病原体。
然而，由于白色念珠菌通常不自然定植于小鼠肠道，既往研究难以在天然宿主环境中解析该真菌与黏膜免疫及炎症之间的相互作用。此外，啮齿类动物完全缺乏灵长类所特有的、可应答细菌代谢物的Vδ2+T细胞群，这使得人类肠道中限制白色念珠菌侵袭的关键免疫机制长期未被阐明。Vγ9Vδ2（Vδ2+）T细胞是一类“非经典”淋巴细胞，可通过BTN3A介导的机制特异性感知微生物代谢物（E）-4-羟基-3-甲基-2-丁烯基焦磷酸（HMB-PP），该代谢物由多种人肠道共生细菌产生，但真菌不产生。既往研究已表明Vδ2+T细胞可促进常规肠道T细胞表达IL-22并在黏膜活检培养中诱导钙卫蛋白释放，但其对肠道屏障抗真菌防御的影响尚不清楚。基于上述背景，研究人员开展了本研究，旨在探索细菌代谢物激活Vδ2+T细胞是否及如何抑制人肠道内源性真菌的生长，并进一步评估该机制在克罗恩病（Crohn's disease, CD）中的状态。
二、研究内容与主要结论
研究人员建立了保留完整上皮结构的人结肠器官培养模型，发现补充HMB-PP选择性激活Vδ2+T细胞可显著抑制肠道组织内源性真菌的过度生长，包括多种耐热霉菌和酵母，其中白色念珠菌最为常见（17株分离株中占11株）。通过中和抗体实验证实，该真菌抑制效应依赖IL-22，而IFNγ中和影响甚微，表明HMB-PP本身无直接抗真菌活性，而是通过Vδ2+T细胞诱导IL-22发挥定植抵抗作用。在CD患者中，肠道黏膜仅含痕量Vδ2+T细胞，经HMB-PP刺激后无明显扩增，且无法限制内源性真菌或外源高致病性白色念珠菌参考株SC5314的生长。对CD患者外周血Vδ2+T细胞的功能分析显示，活动期CD患者的Vδ2+T细胞虽可获得共刺激表型，但其抗原呈递表型显著受损，诱导初始CD4+T细胞表达IL-22的能力明显下降，提示CD中Vδ2+T细胞介导的真菌抑制缺陷同时源于细胞数量减少和功能异常。
对肠道分离的白色念珠菌菌株分析显示，CD来源菌株的细胞壁β-葡聚糖暴露水平增加，体外菌丝延伸能力显著增强，但ECE1基因表达水平与上皮细胞损伤在两组间无显著差异。全基因组测序发现所有肠道来源菌株均携带一个或多个核心菌丝化调控基因的突变，但突变频率在健康供者与CD患者之间无显著差异，提示DNA序列变异本身不足以解释CD菌株增强的菌丝化表型，肠道微环境的表观遗传适应可能发挥重要作用。脉冲SILAC蛋白质组学分析显示，在模拟肠道低氧条件下，CD来源代表菌株CA16显著上调菌丝化调控因子Ihd1p和Sfl2p等蛋白，而健康对照来源菌株CA47则富集营养摄取和组织特异性应激耐受相关蛋白，进一步证实肠道微环境对白色念珠菌表型具有重大影响。
在宿主免疫应答层面，CD来源菌株CA16可显著诱导健康供者中性粒细胞发生NETosis，而CD患者中性粒细胞对两种菌株的NETosis应答差异消失，反映该细胞群在疾病中的功能损伤。在巨噬细胞实验中，CA16诱导的IL-1β释放水平与高毒力参考株SC5314相当，而CA47诱导的IL-1β释放与单纯CLYS毒素对照无显著差异。在自主研发的人“肠芯片”（gut-on-a-chip）模型中，CD来源菌株CA16在生理性液流和蠕动拉伸条件下表现出显著更高的早期上皮黏附能力，并在24小时内大量侵袭至下方血管通道，而健康对照菌株CA47仅显示低水平黏附。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了以下关键技术方法：人结肠器官培养模型（源自内镜检查活检或手术切除黏膜组织，健康对照组n=28，CD组n=43，均来自升结肠）；磁珠富集和流式细胞分选技术分离外周血Vδ2+T细胞及初始CD4+T细胞并进行共培养功能分析；白色念珠菌全基因组测序（Illumina平台）及GATK HaplotypeCaller变异检测流程；脉冲SILAC（pulsed SILAC）定量蛋白质组学分析；中性粒细胞SYTOX Green NETosis定量检测及免疫荧光染色；单核细胞来源巨噬细胞感染实验及IL-1β ELISA检测；以及基于Emulate平台的“肠芯片”器官模型感染实验，该模型包含Caco-2肠上皮细胞和HUVEC血管内皮细胞，施加生理性液流（30 μL/h）和蠕动机械拉伸（10%，0.15 Hz）。
四、研究结果分述
细菌激活人肠道Vδ2+T细胞可限制真菌致病共生菌的生长。 人结肠组织培养中，10 nM HMB-PP处理3天可显著抑制内源性酵母和霉菌的过度生长，包括多形性白色念珠菌及丝状物种绿色木霉（Trichoderma viride）和拟青霉（Paecilomyces variotii）。中和抗体实验证实IL-22是Vδ2+T细胞介导真菌控制的关键细胞因子，而IFNγ中和影响甚微。
Vδ2+T细胞介导的真菌抑制在克罗恩病患者中受损。 健康供者肠道组织经HMB-PP刺激后Vδ2+T细胞显著扩增（平均占T细胞池10.56%），而CD患者黏膜仅含痕量Vδ2+T细胞（平均0.85%）且无法限制真菌生长。活动期CD患者外周血Vδ2+T细胞经HMB-PP刺激后HLA-DR和CD86表达显著低于非活动期，诱导同种异体初始CD4+T细胞表达IL-22的能力也明显受损。
健康供者与CD患者黏膜白色念珠菌菌株的多样性。 白色念珠菌是健康对照和CD组织培养中最常分离的物种。CD来源菌株的β-葡聚糖暴露水平显著升高，菌丝长度显著增加，但ECE1 mRNA表达水平和Caco-2上皮细胞损伤在两组间无显著差异，且上皮损伤与菌丝长度或ECE1表达无直接相关性。
肠道适应型白色念珠菌表型受遗传和微环境因素共同塑造。 全基因组测序显示所有肠道来源菌株均携带核心菌丝化调控基因突变，但频率在两组间无显著差异。在低氧条件下，CD来源菌株CA16显著上调菌丝化调控蛋白Ihd1p和Sfl2p，而健康对照菌株CA47则富集营养摄取和应激耐受相关蛋白。
CD中宿主吞噬细胞对肠道白色念珠菌的应答发生改变。 CD来源菌株CA16诱导健康供者中性粒细胞NETosis水平显著高于健康对照菌株CA47，但CD患者中性粒细胞对两种菌株的应答差异消失。CA16诱导巨噬细胞释放IL-1β的水平与高毒力参考株SC5314相当，而CA47与单纯CLYS毒素对照无显著差异。
人“肠芯片”模型中真菌的快速黏附与屏障侵袭。 在生理性液流和蠕动拉伸条件下，CD来源菌株CA16在2小时内的上皮黏附面积显著高于健康对照菌株CA47，并在24小时内大量侵袭至血管通道，而CA47仅显示低水平黏附。
五、讨论与结论
研究人员指出，肠道γδT细胞在肠道屏障防御中发挥关键作用，其中IL-22在针对黏附侵袭性病原体的早期应答中至关重要。CD患者血液和活检组织中Vδ2+T细胞对HMB-PP敏感性低下且黏膜细胞数量稀少，伴随内源性真菌的快速过度生长。厌氧厚壁菌门（Firmicutes）包含大量产HMB-PP的菌属，而该菌门在CD肠道中显著减少，可能通过破坏HIF-1α/AhR/IL-22信号轴削弱真菌控制。白色念珠菌对哺乳动物肠道的适应是一个复杂过程，不仅受基因型影响，还受肠道微环境的表观遗传效应和宿主免疫变量的塑造。许多IBD风险基因（如CARD9、NOD2）已被认识到在宿主-真菌互作中发挥重要作用。考虑到小鼠与灵长类在肠道生理、常驻菌群和免疫谱上的重大差异，白色念珠菌可普遍定植于人类而非啮齿动物，天然人类宿主可能动用啮齿动物系统所不具备的真菌控制机制，如本研究发现黏膜Vδ2+T细胞可抑制肠道白色念珠菌的生长。由于该轴线的靶微生物和宿主免疫介质在小鼠中均缺失，未来需要替代模型系统来全面理解这一生物学过程。
研究结论： 细菌代谢物HMB-PP可激活人肠道Vδ2+T细胞，通过IL-22依赖机制在健康肠道组织中抑制真菌致病共生菌的生长，而该机制在克罗恩病中因Vδ2+T细胞的数量和功能双重缺陷而发生失调。CD肠道中逃逸免疫控制的白色念珠菌菌株表现出增强的菌丝化、组织黏附与侵袭能力，可触发中性粒细胞NETosis和巨噬细胞IL-1β释放，提示其在CD黏膜炎症中的潜在致病作用。
