《PLOS Genetics》：Enhancing cell type deconvolution in spatial transcriptomics through incorporating multiple reference panels
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空间转录组学（ST）在保留空间背景的同时捕获基因表达，但其分辨率往往使每个空间位置包含多个细胞。因此，细胞类型比例的反卷积至关重要，然而现有方法通常依赖单一scRNA-seq参考，当参考不完整或不匹配时（尤其是在复杂组织中）会限制准确性。这些局限性凸显了对一个
空间转录组学（ST）在保留空间背景的同时捕获基因表达，但其分辨率往往使每个空间位置包含多个细胞。因此，细胞类型比例的反卷积至关重要，然而现有方法通常依赖单一scRNA-seq参考，当参考不完整或不匹配时（尤其是在复杂组织中）会限制准确性。这些局限性凸显了对一个能够整合多个参考并利用空间信息的框架的需求。本研究提出了SWIMR（Spatially Weighted Integration for Multi-Reference deconvolution，空间加权多参考整合反卷积），一个整合多个scRNA-seq参考并考虑空间相关性的统计框架。SWIMR将每个空间位置建模为多个参考的加权组合，细胞类型比例和参考权重均随组织位置变化。在全面的模拟和多样化的ST数据集中，SWIMR始终优于单参考方法。在发育中的人类心脏组织中，研究人员以最高精度恢复了真实的细胞类型组成。在人类肺癌和乳腺癌中，SWIMR描绘了肿瘤、基质和免疫分区，发现了肿瘤邻近的细胞群体，并检测到了其他方法遗漏的细胞类型特异性空间可变基因。在小鼠胚胎和肝癌中，研究人员利用情境特异性参考解决了器官特异性细胞类型的问题，并提高了生物学相关通路的检测灵敏度。综上，这些结果确立了SWIMR作为空间转录组学中多参考反卷积的稳健框架。
论文解读
一、研究背景与问题
空间转录组学（ST）技术能够在保留组织空间背景的同时测量基因表达，为研究细胞在天然微环境中的分布与相互作用提供了新机遇。然而，基于测序的ST平台（如10x Visium）的分辨率有限，每个空间位置（直径约2至100微米）通常包含来自多个细胞的转录本，形成混合基因表达谱。因此，需要计算反卷积方法来估计每个空间位置的细胞类型比例，这对于下游分析（如细胞类型特异性空间可变基因（ct-SVGs）检测）至关重要。
现有参考依赖型反卷积方法（如RCTD、CARD和cell2location）通常假设单一scRNA-seq参考能够完全捕获ST数据集的细胞组成。但在实际应用中，这一假设常因生物变异、技术批次效应或测序平台差异而被违背。尤其在存档组织或临床队列研究中，匹配的scRNA-seq参考往往不可用，研究人员只能依赖部分相关的公共数据集，这种不匹配会引入偏差并降低细胞类型估计的准确性和可解释性。这一问题在肿瘤或发育器官等复杂组织中尤为突出，单一参考无法完全代表潜在的细胞异质性。虽然多参考反卷积在批量RNA-seq分析中已取得成功，但在空间转录组学中仍未被充分探索，需要开发能够考虑数据固有空间相关结构的新方法。
二、研究内容与结论
针对上述挑战，研究人员开发了SWIMR（Spatially Weighted Integration for Multi-Reference deconvolution），一个用于空间转录组学稳健细胞类型反卷积的统计框架。SWIMR将每个空间位置的基因表达建模为多个参考的加权组合，细胞类型比例和参考权重均假设随空间变化。通过引入两层条件自回归（CAR）模型，SWIMR利用空间信息促进相邻组织位置的相似性，从而自适应地分配参考权重、减轻不匹配或不完整参考的偏差，并借用邻近位置的信息增强稳健性。
通过全面模拟和多个真实ST数据集（包括发育中的人类心脏、多器官小鼠胚胎切片、人类肺癌、乳腺癌和肝癌肿瘤样本）的验证，SWIMR始终优于现有方法，在细胞类型组成估计准确性方面表现更佳，并揭示了更深入的生物学见解，如过渡性或肿瘤邻近细胞群体、增强的ct-SVG检测以及疾病相关通路的富集。这些结果确立了SWIMR作为空间转录组学反卷积的强大且可推广的解决方案，尤其在复杂组织架构或参考质量不确定的情境下。
三、关键技术方法
研究人员构建了SWIMR框架，其核心基于非负矩阵分解（NMF）框架，并纳入两层条件自回归（CAR）假设以捕获细胞类型组成和每个scRNA-seq参考贡献的空间相关结构。模型将ST基因表达矩阵建模为多个参考特异性表达矩阵的线性组合，每个参考的贡献由位置特异性权重矩阵控制。第一层CAR假设反映组织生物学基本原则——相邻位置细胞组成更相似；第二层CAR假设是新颖的，假设参考权重在空间上平滑变化。研究人员开发了高效优化策略迭代估计空间变化的细胞类型组成和参考权重。模拟数据基于小鼠嗅球空间坐标和两个scRNA-seq参考数据集构建，设置了完全重叠、部分重叠和不重叠三种细胞类型重叠场景。真实数据应用包括发育中人类心脏（内部和外部两个scRNA-seq参考）、人类肺癌（五个不同平台生成的scRNA-seq参考）、小鼠胚胎（脑、肝、心脏三个器官特异性参考）、人类乳腺癌（四个不同研究来源的scRNA-seq参考）和肝细胞癌（三个独立研究的scRNA-seq参考）。
四、研究结果
模拟研究。 研究人员通过三种重叠场景（部分重叠、完全重叠、不重叠）系统评估了SWIMR性能。在部分重叠场景中，SWIMR获得最低平均RMSE（0.082），优于CARD、RCTD、cell2location和SCDC。在完全重叠场景中，SWIMR性能相当或更优（平均RMSE=0.085）。在不重叠场景中，SWIMR保持稳健（平均RMSE=0.070），而所有其他方法均出现显著性能下降。SWIMR还能准确推断各参考的贡献权重，而SCDC无论真实贡献如何均分配近似相等的权重。
发育中人类心脏数据。 研究人员将SWIMR应用于发育中人类心脏的空间转录组数据集，使用一个内部参考（与ST数据同一平台生成）和一个外部参考（10x Genomics生成）。SWIMR将近全部参考权重分配给内部参考，正确识别其为更具代表性的参考。SWIMR实现最低平均RMSE（0.071），优于RCTD、SCDC和cell2location，与使用单一内部参考的CARD性能相当。
人类肺癌10x Visium数据。 研究人员使用五个不同平台生成的scRNA-seq参考进行反卷积。SWIMR推断的参考权重分布显示Smart-seq2和inDrop参考贡献最突出，与这些平台的优势一致。SWIMR、CARD和RCTD均捕获了相似的肿瘤区域，而cell2location未能检测到任何模式。SWIMR独特地识别了一个此前未定义的"other"细胞群体，高度集中于肿瘤密集区域，其标记基因包括SOX2、ALDH3A1和AKR1C1等已知肿瘤相关基因。CopyKAT分析显示三个参考中"other"细胞含有显著比例的aneuploid（非整倍体）细胞，提示其与恶性肿瘤分区相关。在ct-SVG检测方面，SWIMR独特识别了MMP2（肿瘤细胞）和CDKN2A（"other"细胞）等与肺癌进展相关的基因，GSEA分析显示这些基因富集于凋亡和TNFα-NFκB信号等肺癌相关通路。
发育中小鼠胚胎10x Visium数据。 研究人员整合了脑、肝、心脏三个器官特异性scRNA-seq参考。SWIMR推断的参考权重空间分布与解剖学预期高度一致：脑参考主导神经区域，肝参考定位于内脏区域，心脏参考集中于心脏前体区域。在主要器官特异性细胞类型定位方面，SWIMR准确将胶质细胞定位到神经区域（而RCTD和cell2location错误分配到心脏区域），准确检测Kupffer细胞在内脏区域的富集（其他方法均错误分配到心脏区域），并准确识别远端祖细胞在心脏区域的富集。在次要细胞类型方面，SWIMR正确将小胶质细胞定位到神经区域（RCTD错误分配到肝脏区域），准确将前B细胞定位于肝脏（CARD和cell2location错误分布到非肝脏区域）。在ct-SVG检测中，SWIMR分别识别了神经元、肝细胞和内皮细胞的105、80和71个独特ct-SVG，GSEA分析显示这些基因富集于E2F靶标、G2M检查点、MYC靶标、mTORC1信号、补体、凝血、p53通路和凋亡等发育相关通路。
人类乳腺癌10x Visium数据。 研究人员使用四个不同研究来源的scRNA-seq参考。参考权重分布与各研究的主要关注点一致：Pal B等人的参考（聚焦恶性上皮和肿瘤相关免疫群体）在浸润性癌区域权重较高，Liu等人的参考（涵盖广泛的上皮、基质和免疫细胞类型）在非恶性区域权重较高。SWIMR成功恢复了仅在部分参考中出现的稀有细胞类型（B细胞和癌症相关成纤维细胞）的空间分布，与标记基因MS4A1和COL1A1的表达模式高度一致。在恶性细胞与正常上皮细胞的关系方面，SWIMR获得最高Spearman相关性（0.940），而CARD和RCTD倾向于人为分离这两个群体。SWIMR在恶性细胞、上皮细胞和髓系细胞中分别检测到370、533和791个独特ct-SVG，包括EGF、WLS和CCL2等已知乳腺癌相关基因，GSEA分析显示富集于TNFα-NFκB信号、氧化磷酸化和干扰素α反应等通路。
肝细胞癌10x Visium数据。 研究人员使用三个独立研究的scRNA-seq参考。参考权重分布与H&E图像注释一致：Ma等人的数据集（提供详细肝细胞亚型）在肿瘤区域权重最高，Lu等人的数据集（全面注释基质成分）在免疫和CAF区域权重较高。SWIMR成功恢复了仅在单一参考中出现的双能细胞的分布，与KRT19标记基因表达高度共定位。由于Ma等人和Lu等人参考之间的细胞类型平均表达谱高度一致（Spearman相关性0.93-0.95），主要细胞类型（肝细胞、成纤维细胞和B细胞）的估计在各方法间相似。然而，SWIMR在ct-SVG检测中识别了显著更多的基因：肝细胞中164个额外基因（包括GLUL）、成纤维细胞中320个（包括SFRP2）、B细胞中118个（包括B2M）。GSEA分析显示成纤维细胞中富集于TNFα-NFκB信号、干扰素γ反应和补体等炎症相关通路，B细胞中富集于MYC靶标和干扰素α反应等通路。
五、讨论与结论
SWIMR通过引入两层条件自回归假设，同时捕获细胞类型分布的空间连贯性和每个参考数据集的情境依赖性影响。与简单的多参考共识策略相比，SWIMR显式建模空间变化的参考贡献更为准确。研究人员未对参考进行统一的批次校正，因为过度对齐可能去除有意义的生物学变异，SWIMR通过允许不兼容参考获得较小的空间变化权重来处理这一问题。癌症研究可能特别受益于该框架，因为肿瘤转录组在不同患者和分子亚型间存在差异。SWIMR的局限性包括：最小二乘重建损失未显式建模计数数据的离散、稀疏和过离散特性；当前使用共同的空间核和自相关参数。未来扩展方向包括采用泊松或负二项目标函数、整合组织学或形态学信息、应用于其他ST技术平台，以及扩展到多层次或多样本框架以联合反卷积多个组织切片。
总之，SWIMR通过将多源数据整合与空间感知建模相结合，推进了空间转录组学分析的当前格局，为从日益复杂和异质的数据中提取生物学意义提供了有力工具。
